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突变型NOTCH3(R90C)对少突胶质系细胞HS683增殖的影响及相关分子机制
目的 探讨伴皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)的一种突变型基因NOTCH3 (R90C)对少突胶质系细胞HS683增殖能力的影响及相关的分子机制.方法 (1)以pCMV-Sport6.0为表达载体,采用定点突变法构建突变型基因NOTCH3(R90C)表达载体,真核细胞转染技术分别转染pCMV-Sport6.0空白对照载体、野生型NOTCH3(p.NOTCH3)质粒与突变型NOTCH3(p.R90C)质粒到HS683细胞,分别为转染空白对照载体组、转染野生型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因组.转染后24 h、48 h、72 h、96 h用CCK8法检测3组细胞的增殖水平;转染后72 h Western blotting检测细胞NOTCH3蛋白和细胞周期相关蛋白p53,磷酸化(p)-p53与p21的表达.(2)实验分转染野生型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因组、转染突变型NOTCH3基因+Pifithrin-α组,分别转染野生型、突变型、突变型NOTCH3基因,后2组再分别加入0μmol/L、1μmol/L的Pifithrin-α.转染后24 h、48 h、72 h、96 h采用CCK-8法检测细胞的增殖水平. 结果 (1)转染48h、72 h、96 h后,与转染野生型NOTCH3基因组比较,转染突变型NOTCH3基因组的细胞吸光度值降低,差异有统计学意义(P＜0.05);转染72 h后,转染野生型NOTCH3基因组与转染突变型NOTCH3基因组细胞的NOTCH3蛋白表达量显著高于转染空白对照载体组;Western blotting检测显示转染突变型NOTCH3基因组细胞增殖周期相关蛋白p53、p-p53以及p21的表达量均明显高于转染野生型NOTCH3基因组和转染空白对照载体组,差异有统计学意义(P＜0.05);(2)转染后48 h、72 h、96 h,与转染突变型NOTCH3基因组比较,转染突变型NOTCH3基因+Pifithrin-α组的细胞吸光度值增加,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 突变型NOTCH3(R90C)蛋白通过p53依赖的方式抑制少突胶质细胞的增殖,这可能是NOTCH3(R90C)突变导致CADASIL患者脱髓鞘的另一个新的致病因素.
