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嗜肺军团菌环介导等温扩增检测方法的建立及应用
目的 建立一种灵敏、快速、安全、方便适合口岸现场应用的嗜肺军团菌检测方法.方法 分析嗜肺军团菌基因组序列,选择特异性基因片段设计引物,建立环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LMAP)方法,并优化反应条件.结果 建立的方法特异性好,灵敏度可达103cfu/ml,检测能力与荧光定量PCR法相当.结论 应用环介导恒温扩增技术建立的嗜肺军团菌检测方法,灵敏度高,特异性好,适合现场快速检测.
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环介导等温扩增技术快速检测HPV18方法的建立
目的 应用环介导等温扩增技术(LAMP)对人乳头瘤病毒18(HPV18)进行基因检测,建立一种快速、可视的HPV18核酸检测方法.方法 针对HPV18病毒特异性E6区设计LAMP检测引物,通过调整反应物浓度建立LAMP反应体系,用羟基萘酚蓝(HNB)染料对产物进行可视化判定.通过检测其他不同基因型别的病毒评估引物特异性,检测倍比稀释的临床标本确定其灵敏度,通过LAMP法检测临床标本验证其与PCR法的一致性.结果 利用LAMP方法检测到HPV18病毒E6引物的特异性好,恒温65℃条件下反应60 min即可较好完成检测.LAMP特异性好,灵敏度高,灵敏度为2.5×103拷贝/ml.LAMP可视化结果判定与PCR凝胶电泳结果相当,二者有较好的一致性(P＞0.05).结论 建立了HPV18病毒的LAMP快速、可视化检测方法,该法操作简便快捷,具有很好的开发应用前景.
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环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用效果分析
目的:分析环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用效果.方法:选取我院2013年11月至2015年2月收治的性病患者126例为研究对象,对生殖道分泌物进行检测,同时采用LAMP法、涂片检测和细菌培养方法,分析阳性检测结果和敏感性、特异性.结果:取扩增产物进行酶切片段检测,酶切片段与理论预计相符合,AluI酶切片段包括139bp、70bp,TaiI主要片段包括196bp、160bp、144bp,环介导等温扩增法和PCR检测阳性率无明显差异(P＞0.05),环介导等温扩增法、PCR检测HPV敏感性无统计学差异(P＞0.05),环介导等温扩增法检测CT、淋球菌和TP敏感性均高于PCR检测.结论:常见性病病原体采用环介导等温扩增法检测快速、置管、便捷,敏感性和特异性都较高,无需特殊仪器,具有使用价值.
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常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用
食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在检测成本高、速度慢、效率低等问题，难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多分子生物学技术，它们因准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高等优点，越来越被广泛应用。
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基于RT-LAMP的10种烈性病毒快速检测方法的研究
本研究针对 10 种对人类健康威胁较大的烈性病毒建立反转录-环介导等温扩增法(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification ,RT-LAMP) ,筛选出10种烈性病毒高特异性引物,并分别对这10种病毒进行特异检测.结果显示,其安全、便捷、快速,且高通量.在自主研发的 RT-LAMP体系中,只需加入模板,结合配套仪器,扩增耗时不超过45 min ,检测灵敏度为1~100拷贝/反应(25 μL) .检测30份人血清样品,筛查出1份裂谷热病毒阳性.该方法操作简单,可防止污染,成本低,易携带,方便于低配实验室或现场进行实时高通量检测.结果提示,针对10种烈性病毒的RT-LAMP方法可对口岸等人员流动性大的地区疑似患者进行快速筛查,展现出良好的应用前景.
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环介导等温扩增技术检测蓝氏贾第鞭毛虫
目的 建立应用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测蓝氏贾第鞭毛虫的方法. 方法 体外培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体,提取DNA.根据GenBank显示的贾第虫序列及环介导等温扩增技术的原理,设计4条贾第虫特异引物,利用LAMP检测蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA为对照,并将不含病原体DNA的纯水作为阴性对照.LAMP产物经SYBR green I显色后观察结果,绿色为阳性,棕色为阴性;对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察其特征条带的情况. 结果 蓝氏贾第鞭毛虫DNA检测管经显色后呈绿色,隐孢子虫卵囊DNA、疟原虫DNA及水阴性对照管呈棕色.含有蓝氏贾第鞭毛虫DNA的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,安氏隐孢子虫DNA、恶性疟原虫DNA及阴性对照水无扩增产物. 结论 成功建立了检测蓝氏贾第鞭毛虫的LAMP方法.
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环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫的研究
目的 用环介导等温扩增技术检测牛源隐孢子虫.方法 提取牛粪中隐孢子虫卵囊DNA.根据隐孢子虫18S rRNA序列及环介导等温扩增(100p-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的原理,设计4条隐孢子虫特异引物,利用LAMP检测牛粪中隐孢子虫卵囊DNA和蓝氏贾第鞭毛虫DNA,以正常牛粪DNA为阴性对照.LAMP产物经SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性,对LAMP产物进行电泳分析,观察其特征条带的情况.结果隐孢子虫卵囊DNA检测管经显色后时不再呈绿色,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA呈棕色.隐孢子虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,阴性对照及蓝氏贾第鞭毛虫DNA无扩增产物.结论 LAMP方法敏感、特异、简便,可用于检测牛粪中的隐孢子虫.
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环介导等温扩增技术快速检测结核分枝杆菌核酸
目的 建立一种快速准确的检测结核分枝杆菌(MTB)核酸的环介导等温扩增(LAMP)方法.方法 以重复插入序列IS6110为目的基因,设计LAMP引物,特异检测MTB核酸.用本法与痰涂片抗酸染色镜检法、实时荧光PCR法对100例可疑患者痰标本进行对比检查.结果 LAMP法特异性强,仅扩增MTB复合群核酸；灵敏度高,检测限达100 fg；而实时荧光PCR检测限为1 pg.对100例疑似结核病患者痰液标本检测,涂片抗酸染色法、LAMP法、实时荧光PCR法的阳性率分别为28％、39％和38％.结论 本研究建立的LAMP方法检测MTB核酸特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为临床快速检测MTB的新方法.
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应用环介导等温扩增法进行卡马西平安全用药监测
目的 建立环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测卡马西平引起严重皮肤损害的标志基因HLA-B* 1502的技术平台.方法 对所收集的病例,分别应用LAMP和金标准SSP-PCR进行标志基因HLA-B* 1502的检测,验证LAMP方法的准确性.结果 LAMP和SSP-PCR检测38例对照组和2例药疹组患者基因型结果完全一致.结论 LAMP操作简单快捷,且准确可靠,可以在临床上广泛推广,提高卡马西平安全用药水平.
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环介导等温扩增法在结核病诊断中的应用
目的：研究环介导等温扩增法在不同临床样本中的结核病诊断价值。方法使用环介导等温扩增法检测肺泡灌洗液、局部穿刺液、腹水和脑脊液中的结核分枝杆菌复合群的特异性基因IS1081,并与实时荧光定量PCR进行比较。结果在荷菌量较高的肺泡灌洗液和局部穿刺液中,环介导等温扩增法敏感性比实时荧光定量PCR低(80% vs 92%)；在荷菌量极低的腹水和脑脊液中,环介导等温扩增法敏感性比实时荧光定量PCR高(34．6% vs 15．4%),但特异性略有下降(80% vs 93．3%)；综合计算所有样本的敏感性,环介导等温扩增法与实时荧光定量PCR无显著差别(56．9% vs 52．9%)。结论环介导等温扩增法具有较高敏感性和特异性,可以用于结核病诊断。
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环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫的研究
目的 环介导等温扩增(LAMP)技术检测恶性疟原虫.方法 酚氯仿法提取恶性疟原虫基因组 DNA,设计四条扩增恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的LAMP 引物,以间日疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、人全血DNA为对照,进行LAMP反应.LAMP 产物经显色、电泳鉴定.将原虫血症为1.5%的恶性疟原虫血样用正常人血按1:10倍比稀释为1.5 × 10-3、1.5 × 10-4、1.5 × 10-5、1.5 × 10-6、1.5 × 10-7、1.5 × 10-8 6个浓度后进行LAMP,检测其敏感性.结果 恶性疟原虫检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性).恶性疟原虫 LAMP产物经电泳后呈LAMP 特征性梯状条带,对照组均无扩增产物.LAMP可检测恶性疟原虫的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC.结论 检测恶性疟原虫的LAMP方法 特异、敏感及简便.
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环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型
目的 针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP).方法,实现对HBV的快速检测及基因分型.方法 分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测.方法,并与Real-time PCR.方法 进行临床样本检测结果 比对.结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝.与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右.结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断.
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LAMP快速检测日本血吸虫感染性钉螺的研究
目的：建立一种快速检测日本血吸虫感染性钉螺的方法。方法采用环介导等温扩增技术（LAMP ）以日本血吸虫的特异基因为靶序列，利用Primer Explorer V3软件设计扩增靶基因的4条LAMP引物，酚氯仿法提取感染性钉螺中的日本血吸虫DNA ，取适量模板DNA加入LAMP反应体系进行对日本血吸虫靶基因扩增，经肉眼观察、SYBR Green I染色电泳及测DNA序列来判定扩增产物。在99个阴性钉螺中各加入1个阳性钉螺，其中每个阳性钉螺分别感染日本血吸虫毛蚴数量分别为10、8、6、4、2、1条。结果感染性钉螺检测管经显色呈绿色为阳性，阴性钉螺呈棕色；日本血吸虫的特异基因经LAMP扩增后电泳呈现LAMP特征性梯状条带，阴性钉螺及感染肝吸虫不出现LAMP特征性梯状条带；扩增产物经酶切及序列分析显示为目的基因；在100个钉螺中只要有2条日本血吸虫毛蚴感染便可检出。结论环介导等温扩增技术（LAMP）可快速有效检测日本血吸虫感染性钉螺，有望为疫区日本血吸虫感染性钉螺高效快速检测提供一种新方法。
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环介导等温扩增技术快速检测血液中白色念珠菌
目的 探讨环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测血液中白色念珠菌的可行性.方法 采用通用基因组DNA提取试剂盒提取血液中白色念珠菌DNA,应用LAMP方法进行扩增,采用浊度仪进行检测.结果 该方法能够检测出血液中白色念珠菌,而其它临床常见血流感染的细菌均未被检出.结论 LAMP可作为白色念珠菌菌血症的快速诊断方法.
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环介导等温扩增对肺结核快速诊断的分析研究
目的:探讨环介导等温扩增检测方法在肺结核诊断中的价值.方法:选取408份初诊疑似肺结核患者的痰标本,同时进行直接涂片抗酸染色法、改良罗氏培养基培养法和环介导等温扩增法检测.结果:在检测的408份痰标本,直接涂片抗酸染色法检出阳性标本86份,阳性率21.1％(86/408);培养检出阳性标本112份,阳性率27.5％(112/408);LAMP检出阳性标本110份,阳性率27.0％(110/408).以改良罗氏培养基培养法检测结果为标准,涂片法的灵敏度为72.3％(81/112),特异性为98.3％;LAMP灵敏度为92.9％(104/112),特异性为98.0％.检测结果具有统计学差异(x2=16.42,P＜0.05).结论:LAMP在疑似肺结核患者的诊断中具有较高的灵敏度和特异性,可作为结核病诊断和鉴定的重要依据.
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环介导等温扩增法快速检测痰液标本中的结核分枝杆菌
目的 由于结核病检测技术目前存在灵敏度低,检测周期长的问题,给结核病防治工作带来了诸多不便.多种基因检测技术的出现为结核病的诊断,提供了有利工具.本文通关过使用新型基因扩增法,LAMP法对痰标本中的结核分枝杆菌进行检测.方法 采集54份肺结核疑似患者的临床痰标本,对每份样本使用LAMP法进行检测,并使用痰培养结果 作为金标准.结果 在直接检测痰标本的试验中LAMP的灵敏度为96%,特异性为100%.结论 通过这项研究发现,使用LAMP技术用于痰标本中结核分枝杆菌的检测,可大大缩短检测周期,简化操作步骤,具有成本低、灵敏度高、特异性强的优点,有利于进行结合病的筛查和诊断.
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环介导等温扩增法在常见性病病原体检测中的应用
20世纪70年代后期，性病在我国一些地区死灰复燃，发病地区不断扩大，发病人数直线上升，危害日益严重，从沿海到内地，从城市到农村，从社会到家庭，性病疫情逐步扩散蔓延。据2002年全国对7种常见性病：非淋菌性尿道炎、尖锐湿疣、生殖器疱疹、梅毒、淋病、软下苷、性病淋巴肉芽肿累计报道为744848例，发病率为58．15／10万。另外由于各种原因的漏诊和漏报，中国疾病预防控制中心性病麻风病防治中心的调查结果显示，性病实际发病数是报告数的10～20倍。世界卫生组织估计，我国每年实际新发性病例数为1600～2000万［1］。近十几年来，中国性病发病率每年以20％至30％速度增加，性病已成为五大传染病之一，给社会和人民都带来了严重的危害。为防治和控制性传播疾病，对性病病原体的准确快速检测意义重大。传统的性病检测法大多繁琐费时，不利于性病的早期诊断以及及时控制，因此开发一系列能应用于基层医疗机构的性病病原体检测方法成为当务之急。近年来发展的环介导等温扩增法（LAM P）因为具有特异、敏感及操作简便等特征已用于各种病原体的检测。本研究探讨LAMP在常见性病病原体检测中的可行性及应用前景进行分析，报道如下。
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快速检测HPV16的环介导等温扩增检测法的建立
目的 建立快速检测人乳头瘤病毒16(HPV16)的环介导等温扩增法(LAMP)法.方法 针对HPV16 E7区设计LAMP引物,建立LAMP反应体系,对其检测敏感度进行了验证,并与PCR法、LAMP加环引物法、LAMP试剂盒法进行了比较结果 利用LAMP方法能成功检测到HPV 16病毒E7区的基因,等温条件下反应60 min即可较好完成检测;加入环引物的LAMP法敏感度高于PCR法,与LAMP试剂盒法敏感度一致,为103稀释倍数.结论 LAMP方法具有灵敏度高,操作简便快捷,无需复杂特殊仪器的优点,适用于HPV16病毒的快速检测,具有很好的开发应用前景.
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环介导等温扩增法检测转基因玉米MON88017品系
建立了转基因玉米MON88017品系环介导等温扩增法检测方法.针对MON88017玉米基因组与外源基因结合处序列,设计5条特异引物,并对反应条件、特异性、灵敏度、稳定性、结果判断方法等参数进行研究,同时与实时荧光PCR检测方法进行比较,终进行了5家同类型实验室的协同验证.结果表明本研究所建立的MON88017环介导等温扩增检测方法具有良好的特异性,其低检出限为0.5％,在特异性、灵敏度和检测范围等指标上均优于传统的PCR技术,并且不依赖昂贵的大型设备,可以实现现场快速检测,检测成本与检测所需时间远低于实时荧光PCR.该方法具有快速、简便的优点,能满足实际工作要求.
