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多重聚合酶链反应方法在结核杆菌检测中的应用
[目的]建立结核病诊断及快速检测方法.[方法]将结核杆菌标准菌株、临床病例标本、对照标本采用多重PCR体系进行检测,以研究多重PCR方法对上述菌株检测的敏感性和特异性.[结果]多重PCR体系检测结核杆菌DNA的灵敏性低为30-210个结核杆菌,对结核病病例和对照标本检测的灵敏度为94.6%,特异度为100%.[结论]多重PCR技术用于结核分支杆菌的鉴定简便、快速、特异,适于在卫生检疫系统和临床实验室应用.
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基于扩增后分析的单管双重荧光PCR方法的建立
目的 建立单通道双重荧光PCR方法检测寨卡病毒和基孔肯雅病毒,为探索超多重荧光PCR方法奠定基础.方法 根据TOCE原理,首先在寨卡病毒的TaqMan探针荧光PCR技术基础上,设计两条含有不同标签序列的杂交探针,通过寨卡病毒毒株选择合适的标签序列,再根据合适的标签序列设计合成两条理论上解链温度不同的检测探针,同样用寨卡病毒毒株评估两条检测探针;接着按相同原则设计合成基孔肯雅病毒的杂交探针和检测探针,进行单管内单通道双重荧光PCR试验.结果 标签序列的选择结果表明,只有当标签序列的解链温度低于荧光PCR的退火延伸温度时,阳性样本才能获得相应的扩增曲线;根据合适的标签序列设计合成的两条理论上解链温度不同的检测探针,实际检测时可以在同一检测通道中通过融解曲线分析准确区分.单管双重荧光PCR可准确检测出基孔肯雅病毒、寨卡病毒的毒株和阳性样本.结论 建立了一种针对基孔肯雅病毒和寨卡病毒的单通道双重荧光PCR检测方法,为后续多种虫媒病毒超多重荧光PCR检测方法的开发提供借鉴.
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中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立
建立中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染的筛查与诊断应用的核酸检测方法.本研究建立了基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重的三种荧光定量RT-PCR检测技术方法,分别与前期建立的单重荧光定量RT-PCR(upE或N2)检测方法做了比较,并且采用MERS-CoV病毒毒株、上海提供的口岸发烧病人样本以及由首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品和全血的样品做了临床验证.结果显示:采用MERS-CoV病毒毒株作为模板,三种新建立的多重检测方法与单重荧光定量RT-PCR检测方法低检测限均能达到10 PFU/mL,且与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应,特异性良好.对临床样品的验证中,上海病人咽拭子样本均为阴性,而中国首例MERS输入病例的急性期咽拭子样品均为阳性,而全血样的检测结果显示N2靶标有较高检出率,明显优于基于upE单一靶标.本研究所建立的基于MERS-CoV三个分子靶标(upE,ORF1b,N2)的双重以及三重荧光定量RT-PCR检测技术方法用于MERS-CoV感染的实验室诊断,具有较高灵敏度与特异性及适用性.
关键词： 中东呼吸系统综合征 冠状病毒 荧光定量RT-PCR 多重 检测 -
GeXP多重基因表达系统检测外周炎性相关基因方法学探索
拟通过使用GeXP多重基因表达系统检测健康人和不同疾病外周血中炎性因子及相关基因的表达.使用GeXP多重基因表达系统对血中基因进行检测,并以β-ACTIN作为参考基因,得到血中基因表达的相对含量.优化实验体系,在不同疾病中基因表达有不同的改变.建立了外周血细胞炎性相关基因检测的条件,并对引物进行优化,为多重PCR检测技术的临床开展提供了新的思路和技术支持.
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多重荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征患者复杂核型异常
目的探讨多重荧光原位杂交(M-FISH)技术在骨髓增生异常综合征(MDS)患者复杂核型异常检测中的应用价值.方法对10例常规R显带具有复杂染色体异常(CCA)的MDS患者应用M-FISH确定复杂染色体的重排及标记染色体的组成,识别并确定微小易位.结果 M-FISH共检出37种结构重排,包括插入易位、缺失、易位及衍生染色体.其中34种为不平衡重排;3种为平衡重排,包括:t(6;22)(q21;q12)、t(9;19)(q13;p13)和t(3;5)(?;?).有7种重排文献未见报道.涉及17号染色体的异常及-5/5q-为常见(10例患者中两种异常各占7例).结论对伴有CCA的MDS患者M-FISH技术可以明确常规细胞遗传学(CC)分析中复杂染色体异常,并发现和纠正CC分析中漏检及误检的异常.为MDS患者染色体异常的分析提供了一种较理想的方法.
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多重荧光原位杂交技术检测急性髓系白血病复杂核型异常的价值
目的探讨多重荧光原位杂交技术检测急性髓系白血病(AML)患者复杂核型异常的价值.方法联合应用常规细胞遗传学、间期荧光原位杂交技术和多重荧光原位杂交技术对14例伴有复杂核型异常的AML患者进行研究.结果14例AML患者应用常规细胞遗传学技术共检出23种染色体的数量异常和56种染色体的结构异常.常规细胞遗传学技术检出的4种染色体增加和4种染色体丢失与多重荧光原位杂交技术分析结果一致,常规细胞遗传学技术检出的12种染色体丢失经多重荧光原位杂交技术证实为衍生染色体.常规细胞遗传学技术检出的26种衍生染色体和19种标记染色体的性质被多重荧光原位杂交进一步明确.它们中大多数是由染色体不平衡易位所致,包括2种尚未报道的复杂t(8;21)易位:t(8;21),der(8)t(8;21)(8pter→8q22::21q22→21qter),der(21)t(8;21;8)(8qter→8q22::21p13→21q22::8q22→8qter)和t(21;8;18;1),der(8)t(8;21)(8pter→8q22::21q22→21qter),der(21)t(21;8;18;1)(21p13→21q22?::8q22→ 8q24?::18??::1q??q??).复杂核型异常几乎涉及所有染色体,但以17,7和5号染色体多见.结论AML的复杂核型异常单用常规细胞遗传学分析常难以阐明,而联合多重荧光原位杂交则可以更好的揭示其特征.因此对伴有复杂核型异常的AML患者,好进一步采用多重荧光原位杂交技术进行分析.
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多重PCR法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病患者克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因重排
目的 应用多莺PCR方法检测初诊成人急性淋巴细胞白血病(ALL)患者的克隆性免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)基因重排,为实时定量RT-PCR(RQ-PCR)法监测ALL患者体内的微量残留病(MRD)奠定基础.方法 参照BIOMED-2协作组制定的Ig和(或)TCR检测方法,设计96条不同的PCR引物,分成14个混合管,通过多重PCR,分别检测患者骨髓单个核细胞的IgH、IgK、TCRB、TCRG、TCRD克隆性基因重排.结果 在22例成人B系ALL患者中,Ig克隆性重排检出率为96%,其中IgH为86%,IgK为14%.在18例成人T系ALL患者中,TCR克隆性重排检出率为100%,其中TCRB为83%,TCRG为78%,TCRD为39%.两个及两个以上克隆性标志物的检出率在B和T系ALL中分别为91%(22例中20例)和89%(18例中16例).结论 BIOMED-2协作组设计的14管多重PCR引物和方法,几乎可检测到淋巴细胞白血病患者体内所有占优势的克隆性T、B细胞增殖群体,方法简便、可靠、覆盖面广,适用于成人ALL患者基因重排检测和MRD监测.
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常规细胞遗传学检查联合多重荧光原位杂交技术确定急性白血病患者复杂核型异常
目的 探讨多重荧光原位杂交(M-FISH)技术在急性白血病(AL)患者复杂核型异常和标记染色体检测中的应用价值.方法 对11例常规R显带检测显示具有复杂核型异常和标记染色体的AL患者应用M-FISH技术确定复杂染色体重排和标记染色体的组成,识别并确定微小易位和隐匿易位.结果 11例AL患者应用常规细胞遗传学(CC)技术共检出27种染色体数目异常和41种结构异常.CC技术检出的3种染色体增加和9种染色体丢失以及12种结构异常与M-FISH分析结果一致,CC技术检出的15种染色体丢失经M-FISH证实为衍生染色体,M-FISH还检出3种CC检查未发现的染色体数目增加.CC检查所检出的其余29种结构异常(包括17种标记染色体)的性质被M-FISH进一步明确.M-FISH共检出33种结构重排,有6种异常未见文献报道,分别为t(5q-;16)(?q14;q24)、der(9)(Y::9::Y::9)、der(7)(7::8::9)、ins(20;21)、der(11)(11::21::20)和der(3)t(3p-;13)(3p-;q21),这些复杂染色体重排主要由染色体不平衡易位所致.复杂核型异常几乎涉及所有染色体,在AML患者以涉及17、5、7、15和11号染色体的异常较为常见;在ALL患者则以涉及8、9、14和22号染色体的异常较为多见.结论 联合应用CC和M-FISH检查可以提高CC核型分析的分辨率,对伴复杂核型和标记染色体的AL具有一定的临床应用价值.
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应用多重标记技术对霍奇金淋巴瘤H/RS细胞属性及生物学行为的研究
目的探索细胞凋亡相关基因、蛋白与经典型霍奇金淋巴瘤(CHL)的相关关系及H/RS细胞的属性.方法选用山西省肿瘤医院62例存档CHL.用免疫组化ABC法检测bcl-2、CD3、CD20、CD30、CD15和CD10;免疫组化双标记技术检测RS细胞表达P53;ABC和DNA末端标记双标记技术检测细胞凋亡;免疫组化和原位杂交双标记技术检测H/RS细胞表达κRNA和λRNA;多重标记检测背景中非肿瘤性T、B细胞的分布特点.结果62例CHL中14例(22.58%)表达P53蛋白,35例(56.45%)表达bcl-2蛋白.62例背景非肿瘤细胞均有细胞凋亡,仅有10例H/RS细胞出现凋亡,表达bcl-2的H/RS细胞凋亡与其bcl-2的表达呈负相关(P=0.02).H/RS细胞CD30全部阳性,41例表达CD15,8例表达CD20,62例均不表达CD3、MPO、bcl-6、CD10、κRNA和λRNA.非肿瘤性T细胞围绕H/RS细胞呈玫瑰花样,B细胞分布在其外围.结论CHL中H/RS细胞对B系细胞标志有较大的变异.T、B淋巴细胞和H/RS细胞的分布特点可作为诊断的参考指标.多重标记可突出研究的目标细胞,从而有针对性的对H/RS细胞进行研究.P53的异常表达在CHL可能不起主要作用.bcl-2过度表达可能抑制细胞凋亡.
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浅谈多重耐药菌医院感染的预防与控制
预防与控制多重耐药菌感染工作,是预防医院感染发生的关键.制定《多重耐药菌感染病例单独隔离基本措施》,严格遵守各项规章制度,是预防控制医院感染的重要手段.本院实施措施和规章制度12个月,检出多重耐药菌44种,无发生多重耐药菌医院感染.
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山东汉族RhD阴性个体基因多态性研究
目的 研究山东汉族人群RhD阴性个体RhD基因多态性.方法 采用标准血清学方法和抗球蛋白实验筛选Rh阴性个体;对Rh阴性个体再用吸收放散实验确定DEL型.运用多重聚合酶链反应(PCR)方法分析RhD阴性个体基因存在情况.结果 67例Rh阴性个体中DEL型16例,占Rh阴性个体的23.88%,其6个RhD基因特异性的第3、4、5、6、7、9外显子全部存在;剩下51例Rh阴性个体中1例缺失第5外显子,其余50例6个外显子全部缺失.结论 山东汉族人群RhD阴性个体中存在一定比例的DEL型,且所有DEL样本均具有完整的RhD基因,在排除DEL型后的RhD阴性个体可能携带RhD基因,但其比例较低.
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多黏菌素类治疗多重耐药革兰阴性菌感染的临床应用进展
近年来,多重耐药(multiple drug resistance,MDR)革兰阴性菌所致的重症感染日渐增多,是导致医院感染患者预后不佳的重要原因[1].流行病学研究显示,医院难治性感染的MDR细菌以铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌较为常见和重要[1-2].碳青霉烯类抗生素被认为是治疗该类感染较为有效的药物.然而,近年国内外耐药监测的结果显示,临床分离的不发酵糖菌对其耐药率呈现出明显上升趋势,可供选择的抗菌药物极为有限,但对多黏菌素耐药率较低,促使了对其临床应用价值的重新认识和再评价[3-4].临床观察资料显示,多黏菌素B或E可能是目前对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌为有效的抗菌药物之一,多数患者在指导剂量下全身给药后耐受情况良好,不良反应发生率较低且轻微,与早期的临床观察结果存在较大差异[4-5].因此,多黏菌素B或E目前已成为欧美国家控制MDR革兰阴性菌医院感染较为常用的有效抗菌药物,本文拟对其近年来的耐药监测结果和临床应用概况进行介绍.
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鲍曼不动杆菌临床分布及耐药性变迁
目的 了解鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药性变迁情况,为指导临床用药和控制感染提供依据.方法 2008年1月至2011年12月临床分离总细菌4 261株,其中鲍曼不动杆菌554株(13.0％),均采用VITEK-32自动微生物分析系统行细菌鉴定和药敏试验.回顾性分析4年来鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药性.结果 4年间分离的554株鲍曼不动杆菌主要来源于呼吸道标本,占92.1％(510/554),且主要集中在重症监护病房和神经外科等科室；该菌对大多数抗菌药物耐药严重,妥布霉素、头孢哌酮舒巴坦、阿米卡星及左氧氟沙星耐药率相对较低,临床感染率逐年增高,2008年为8.0％,2011年升至15.1％ (P＜0.01)；多重耐药和泛耐药率逐年递升,2008年为44.8％,2011年升至84.4％ (P ＜0.01).结论 临床在合理使用抗生素的同时要加强对鲍曼不动杆菌的耐药性监测,并采取有效措施避免和减少多重耐药鲍曼不动杆菌的传播和爆发流行.应积极开展临床药物研究,研制和筛选出有效治疗药物.
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儿科重症监护室单一和多重呼吸道病毒感染对比分析
目的 探讨儿科重症监护室(PICU)患儿单一和多重呼吸道病毒感染情况的差异.方法 收集406例入住汕头大学医学院第二附属医院PICU合并有呼吸道感染患儿的咽拭子样本,采用多重PCR及常规PCR对咽拭子行16种呼吸道病毒检测,分析阳性病例的病毒感染情况及与患儿临床特征的关系.结果 406例样本中病毒检测阳性者252例,阳性率62.1％.阳性样本中,以其中鼻病毒(HRV)检出率高,为105例(41.7％),其次为呼吸道合胞病毒(RSV)[63例(25.0％)]和腺病毒(HADV)[48例(19.0％)];单一病毒感染177例(70.2％),多重病毒感染75例(29.8％),包括66例双重病毒感染,9例三重病毒感染.多重病毒感染多的病毒组合是HRV+RSV(16例).单一病毒感染和多重病毒感染的患儿中存在基础疾病的病例数分别为46例和6例,两者差异有统计学意义(x2=10.409,P＜0.01);而二者在性别、年龄、住院时间、上下呼吸道感染人数及小儿危重症评分上差异均无统计学意义(x2=3.430,Z=0.315,Z=0.336,x2=0.041,P均＞0.05).结论 呼吸道病毒是PICU中呼吸道感染性疾病的主要病原体之一;存在基础疾病的患儿以单一病毒感染为主,多重病毒与单一病毒感染对于疾病严重程度的影响没有明显差异.
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多重RT-PCR快速检测鉴别H7亚型禽流感病毒方法的建立
目的参考AIV M基因和HA基因序列,设计了两对引物.其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ H7-1和XZ H7-2为H7亚型特异性引物,跨幅634 bp.利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别H7亚型AIV的多重RT-PCR技术.特异性和敏感性试验结果表明,该技术对H7亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和634 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244 bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR对AIV RNA的低检出量为1pg,对H7亚型AIV RNA的低检出量为10pg.
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多重反转录聚合酶链反应检测H5亚型禽流感病毒方法的建立
目的根据A型AIV的M基因和HA基因序列,设计了两对引物.其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可检测所有A型AIV,跨幅为244bp;XZH5-1和XZH5-5为H5亚型AIV特异性引物,跨幅为860 bp.通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了快速检测鉴别H5亚型AIV多重RT-PCR.该多重RT-PCR对H5亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段,对其他A型AIV只扩增出244 bp的cDNA片段,对其它常见禽病病原则无244 bp和860 bpcDNA片段出现.该多重RT-PCR对H5亚型AIV RNA低检出量为10pg.该多重RT-PCR对AIV人工感染鸡临床样品和鸡胚分离物进行检测,结果其检出率为100%.
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儿科耐青霉素肺炎链球菌和多重耐药菌株的监测与分析
目的：监测耐青霉素肺炎链球菌( PRSP)和多重耐药菌株( MDRO)的构成比及耐药率，了解耐药菌株的发展状况。方法收集2015年1—6月儿科所有PRSP、青霉素肺炎链球菌敏感株( PSSP)和MDRO分离情况资料，对常用抗菌药物的耐药率进行统计，并与2014年进行对比分析。分析耐药菌株产生的原因，找出应对耐药菌株发展的策略。结果 PRSP占9.9%；PSSP占15.9%；MDRO占20.3%，其中，产超广谱β内酰胺酶占50%，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌占41.4%，耐甲氧西林凝因酶阴性葡萄球菌占8.6%。 PRSP和MDRO对儿科常用抗菌药物的耐药率总体呈上升趋势，对不常用的抗菌药物总体呈下降趋势。结论根据PRSP和MDRO对各类抗菌药物的敏感情况，为临床经验抗感染治疗提供依据。 MDRO的流行播散对临床构成严重威胁，医院应采取有效防控措施，遏制耐青霉素肺炎链球菌和多重耐药菌株的蔓延。
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多重-PCR检测CTX-M超广谱β-内酰胺酶基因
目的建立一种多重PCR方法在肠杆菌中检测所有组的CTX-M基因.方法设计两组引物可分别在两个区域检测所有CTX-M组的大多数blaCTX-M基因.一条四组CTX-M基因的共同保守区引物与另外四条逆向引物或五条逆向引物一起同时使用可分别检测出每一组特异性CTX-M基因.PCR反应混合物体积25 ul含每条引物25 pM.对6株标准菌株(产CTX-M-26的肺炎克雷伯菌1株,分别产CTX-M-3,CTX-M-9及CTX-M-15的大肠杆菌各1株,产CTX-M-14的大肠杆菌2株)和90株临床分离株进行CTX-M检测.结果已知携带CTX-M的菌株作为标准均获得预期PCR产物,对90株临床分离株应用多重-PCR扩增,有68株获得阳性结果.进一步测序及分析显示,这些基因均为编码CTX-M-15超广谱β-内酰胺酶的基因.结论我们已成功设计一种多重PCR在单一反应管可同时检测多种CTX-M基因无须多次PCR反应.此方法可以快速准确检测出ESBLs表型阳性菌中CTX-M基因.
关键词： 多重 多聚酶链反应(PCR) CTX-M 超广谱β-内酰胺酶 基因 -
多重耐药菌的感染防控
细菌耐药是全球性难题,尤其是由于临床医生过多的使用抗生素,造成对基因突变及耐药基因转移的耐药菌进行了筛选,给耐药菌的生长提供了温床,使得耐药菌患者增多.这给医院及医务工作者带来困惑,更给感染控制工作带来挑战,多重耐药菌感染防控应从以下工作做起.
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儿童社区获得性肺炎革兰氏阴性多重耐药菌的分布与耐药率分析
目的：了解海口市儿童社区获得性肺炎住院患者感染革兰氏阴性多重耐药菌的分布与耐药率，为降低患者感染率及耐药率提供依据。方法选取2012年1月至2014年12月我院儿科6岁以下社区获得性肺炎住院患者入院后送检的9569份痰液标本进行细菌学分离及培养，对革兰氏阴性多重耐药菌的分布及耐药率进行分析。结果送检的9569份标本中分离出病原菌3740株，占39.08%；3740株病原菌中分离出多重耐药菌408株，占10.9%，主要是ESBLS(+)大肠埃希菌(ESBLs-ECO)、ESBLS(+)肺炎克雷伯菌(ESBLs-KPN)、多药耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)、多药耐药鲍曼不动杆菌(MDR-AB)，其中ESBLs（+）肺炎克雷伯及大肠埃希菌为主要多重耐药病原菌。ESBLs（+）肺炎克雷伯及大肠埃希菌阳性率有逐年上升趋势。各年龄段革兰氏阴性多重耐药菌以ESBLs （+）肺炎克雷伯及大肠埃希菌所占比例高，且主要分布在婴儿组，分别为19.6%及14.8%。革兰氏阴性多重耐药菌对氨苄西林、阿莫西林克拉维酸钾及头孢菌属类抗生素耐药率在80%以上，对妥布霉素耐药率为5%~40%，对复方新诺明耐药率为10%~53%，对左氧氟沙星耐药率为5%~10%，对哌拉西林他唑巴坦耐药率在12%以下，对阿米卡星及亚胺培南耐药率低在6%以下。结论 ESBLs(+)肺炎克雷伯及大肠埃希菌是海口地区6岁以下儿童社区获得性肺炎革兰氏阴性多重耐药菌主要致病菌，婴幼儿为感染高危人群，应加强监测。多重耐药菌对常用抗生素耐药率高，规范使用抗生素是控制耐药率的重要途径。
