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人era的结构特点分析及其定点突变体的构建
目的构建近克隆的人era基因的定点突变体.方法利用数据库对era的结构特点进行分析,在此基础上用改良的重叠延伸法分别构建人Era N端和C端的定点突变体.结果获得了分别针对人Era N端TGP结合结构域(位于29-36氨基酸残基)和C端具有RNA结合活性的KH结构域(位于297-340氨基酸残基)的定点突变体.结论人era定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础.
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重组人Era蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性测定
目的:为了得到可溶性表达的人Era(hEra)蛋白,并检测其生物学活性.方法:把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆人表达质粒pMAL-p2x中.pMAL-hEra转化大肠杆菌TB1,用异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:pMAL-hEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在,表达量占菌体总蛋白的23.9%.再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化,接着用因子X将融合部分切除,但切除后的hEra蛋白不稳定,随着时间的延长而被降解.活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合,并具有GTP酶的活性.结论:可溶性表达了人Era蛋白,并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白,这对人era基因的功能研究具有重要意义.
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兔抗人 ERA抗血清的制备
目的在大肠杆菌中表达人 ERA蛋白 (h-ERA)和 h-ERA C端结构域蛋白，并制备兔抗 h-ERA抗血清。方法以 PCR扩增人 era基因 (h-era)全长 cDNA 和 h-ERA C端的结构域基因，并分别克隆到 (His)6融合表达载体 pRSET-C 和非融合表达载体 pDH中，诱导表达 (His)6-h-ERA融合蛋白和 h-ERA C端结构域蛋白。用 h-ERA C端结构域蛋白免疫兔，制备兔抗 h-ERA抗血清，并以 Western-blot对兔抗 h-ERA抗血清进行鉴定。结果大肠杆菌中表达的 h-ERA C端结构域蛋白和 (His)6-h-ERA融合蛋白，分别占菌体总蛋白的 40％和 80％。用兔抗血清可检出大肠杆菌中表达的 (His)6-h-ERA融合蛋白。结论 h-ERA和 h-ERA C端结构域蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，并成功地制备了兔抗 h-ERA抗血清。
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人Era和人Era C端蛋白在大肠杆菌中的高表达
目的在大肠杆菌中的高表达人Era和人Era C端蛋白. 方法 PCR扩增人era基因（h-era）的全长cDNA和h-era cDNA 的C端区域基因. h-era cDNA克隆到(His)6融合表达载体pRSET-C中，构建融合表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达(His)6-h-Era融合蛋白；h-era cDNA 的C端区域基因克隆到非融合表达载体pDH中PL启动子下游，转化大肠杆菌TAP106，42℃热诱导表达人Era C端蛋白（h-Era-C）. SDS-PAGE电泳、凝胶薄层扫描检测蛋白的表达. 结果表达的(His)6-h-Era融合蛋白产物占全菌总蛋白的80%；人Era C端蛋白占全菌总蛋白的40%. 结论人Era蛋白和Era C端蛋白在大肠杆菌中获得了高表达.
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人era基因的克隆测序及表达
目的克隆人的era基因(简称Hera)并利用大肠杆菌进行表达. 方法 PCR扩增Hera基因,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pGEX-4T3,受控于Ptac启动子,重组质粒pGEX-Hera以大肠杆菌DH5α为宿主菌,用IPTG进行诱导表达. 结果克隆了Hera基因, 测序正确;含重组质粒pGEX-Hera的菌体诱导后在SDS-PAGE上出现一条新生蛋白带,相对分子质量为65 ku,占菌体总蛋白的23%. 结论成功扩增、克隆Hera基因,并在大肠杆菌中得到高效表达.
