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碘化N-正丁基氟哌啶醇通过非外钙机制抗心肌细胞缺氧复氧损伤
目的 研究碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对大鼠心肌细胞无外钙缺氧/复氧(H/R)损伤的作用及其机制.方法 建立无外钙(零钙液)的心肌细胞H/R模型,于缺氧液及复氧液中加入1×106 mol/L的F2.倒置显微镜下观察细胞形态结构及搏动的变化;采用蛋白印迹法检测心肌细胞磷酸化ERK(p-ERK1/2)、总ERK1/2蛋白表达的变化.结果 零钙液H/R可引起培养心肌细胞形态结构呈损伤性改变,包括胞体收缩、伪足减少和搏动无力；零钙液H/R可引起培养心肌细胞p-ERK1/2表达增加,但不影响总ERK表达,即可激活培养心肌细胞ERK1/2;F2可以改善零钙液H/R状态下心肌细胞形态结构的损伤.F2对零钙液H/R心肌细胞p-ERK1/2高表达具有抑制作用,但不影响总ERK的表达.结论 F2可通过非外钙依赖机制拮抗心肌细胞H/R损伤,这可能与其抑制零钙液H/R状态下ERK1/2的激活密切相关.
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Omi/HtrA2在大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧模型凋亡中的作用
目的 研究在大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡模型中Omi/HtrA2的表达,并观察抑制Omi/HtrA2表达后细胞凋亡的变化.方法 用脂质体介导的基因转染方法将Omi/HtrA2的特异性shRNA表达载体251(Pgenesil-1/Omi/HtrAl shRNAl)和252(Pgenesil-1/Omi/HtrA2 shRNA2)及阴性质粒HK(Pgenesil-1/HK)分别转入NRK-52E.应用Western印迹方法检测Omi/HtrA2及caspase3的表达,用DNA ladder检测各组细胞发生凋亡的情况.结果 带有绿色荧光的NRK-52E即为成功转染细胞;在Western biot结果显示:对照组在缺氧复氧后Omi/HtrA2表达较正常组明显增强,而在转251和252组Omi/HtrA2表达较对照组减弱(P<0.05),但251和252两组间差异无统计学意义.对照组caspase3的表达明显较正常组增强(P<0.05).且在Omi/HtrA2被抑制的两组caspase3的明显较对照组(P<0.05).DNA ladder也显示:在对照组出现典型的DNA条带.251和252组条带减弱.结论 通过RNA干扰技术成功抑制了Omi/HtrA2缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2的表达,从而抑制了凋亡的发生.
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三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制及HSP70表达影响的研究
目的：探讨三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护机制及HSP70表达的影响。方法：选择刚出生的SD大鼠作心肌细胞原代培养及缺氧/复氧模型。将原代培养大鼠心肌细胞分为5组，A组为对照组；B组为缺氧/复氧对照组；C组为三七二醇低浓度组，D组为三七二醇中浓度组，E组为三七二醇高浓度组。用免疫组织化学法检测HSP70的表达，用生化比色法检测LDH活力。结果：三七二醇对SD大鼠缺氧/复氧心肌细胞具有明显保护作用，保护作用与三七二醇浓度有关。随着三七二醇浓度增加，缺氧/复氧心肌细胞HSP70表达增加，同时随时间延长，SD大鼠缺氧/复氧损伤心肌细胞内HSP70表达增加。结论：三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞保护作用可能与HSP70表达增加有关。不同浓度的三七二醇对缺氧/复氧心肌细胞的保护均起一定作用。
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培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型与黄芩苷的影响
目的:观察黄芩苷对纯化培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制.方法:实验于2006-11/2007-01在郑州大学医学院药理实验室完成.①实验分组:选用出生1～3 d的SD大鼠20只,雌雄不拘,培养乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型.实验分为5组:正常对照组以正常细胞培养,加入等数量的培养基,不加入任何药物,缺氧/复氧损伤模型组,缺氧/复氧损伤+0.1 mg/L黄芩苷组,缺氧/复氧损伤+1 mg/L黄芩苷组,缺氧/复氧损伤+10 mg/L黄芩苷组.②实验评估:采用乳酸脱氢酶试剂盒测其释放量;采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活力;硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量;四唑盐比色法测定心肌细胞活力.结果:①丙二醛含量和乳酸脱氢酶活力:缺氧/复氧损伤组明显高于正常对照组(P＜0.01),缺氧/复氧+10,1,0.1 mg/L浓度黄芩苷组明显低于缺氧/复氧损伤组(P＜0.01).②心肌细胞超氧化物歧化酶活性:缺氧/复氧损伤组明显低于正常对照组(P＜0.01),黄芩苷+10,1,0.1 mg/L浓度黄芩苷组明显高于缺氧/复氧损伤组(P＜0.01).③心肌细胞活力:缺氧/复氧损伤组心肌细胞活力明显低于正常对照组,缺氧/复氧+10,1,0.1 mg/L浓度黄芩苷组明显高于缺氧/复氧损伤组(P＜0.01).结论:黄芩苷具有对缺氧/复氧损伤所致心肌细胞的保护作用,可能与其抗氧化、抗自由基有关.
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黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖及再灌注后内皮细胞与中性粒细胞黏附的影响
目的:观察黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞的增殖效应及其对再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与人外周血中性粒细胞黏附作用的影响.方法:实验于2006-07/12在北京中医药大学东直门医院中医内科重点实验室完成.①实验材料:原代人心脏微血管内皮细胞(ScienCell公司);黄芪多糖(惠州市东方植物保健科技有限公司).②实验过程及评估:实验使用体外培养的人心脏微血管内皮细胞第4,5代细胞,采用倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况;以四甲基偶氮唑盐法检测经不同浓度黄芪多糖处理24 h,以及经黄芪多糖100,50,25 mg/L分别处理4,6,8 h后的增殖变化;以体外缺糖缺氧2 h模拟体内缺血,复糖复氧6 h模拟再灌注复制人心脏微血管内皮细胞再灌注损伤模型;虎红法测定经缺氧再复氧处理后的人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附;免疫细胞化学法和图象定量分析系统观察细胞间黏附分子1的蛋白表达变化.结果:①人心脏微血管内皮细胞形态和生长情况:人心脏微血管内皮细胞复苏48～72 h后细胞呈铺路石样生长,在15个细胞倍增周期内,其形态、生物、生理学特性稳定.②不同浓度黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:黄芪多糖浓度≥5 g/L时,对细胞生长具有抑制作用(P＜0.05或0.01);浓度为2.5 g/L时,对细胞的增殖无影响;浓度在1.25 g/L～18.78 mg/L时,可明显促进细胞的增殖(P＜0.05或0.01).③黄芪多糖处理不同时间对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:经黄芪多糖100,50,25 mg/L 3个剂量分别处理4,6,8 h后,其增殖与正常对照组比无明显变化.④黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞与中性粒细胞间黏附作用及人心脏微血管内皮细胞细胞间黏附分子1蛋白表达的影响:黄芪多糖50 mg/L可显著抑制再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附(P＜0.01);100 mg/L可明显降低人心脏微血管内皮细胞的细胞间黏附分子1蛋白表达(P＜0.05).结论:①黄芪多糖在一定浓度范围内可促进人心脏微血管内皮细胞的增殖,但需较长的作用时间才能发挥促增殖效应.②黄芪多糖对缺血再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞具有保护作用,其作用机制可能与促进再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞增殖修复,降低人心脏微血管内皮细胞表面细胞间黏附分子1蛋白表达,进而抑制与外周血中性粒细胞的黏附有关.
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黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附能力及细胞核转录因子κB表达的影响
目的:采用人脐静脉内皮细胞缺氧复氧模型模拟器官组织缺血-再灌注所诱导的血管改变,观察黄芪甲苷对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞与中性粒细胞黏附及细胞核转录因子κB表达的干预作用.方法:实验于2005-0912006-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所细胞生物工程实验室进行.①实验材料:新生儿脐带(由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属知情同意,实验符合赫尔辛基宣言中的伦理学标准).②实验过程及分组:人脐静脉内皮细胞原代培养,传至3代后,随机分为3组.对照组:常规培养:缺氧/复氧组:先缺氧处理1 h,再复氧1 h;药物干预组:在培养液中加入终浓度分别为20,40,80 mg/L的黄芪甲苷预处理,12 h后进行缺氧/复氧处理.③实验评估:分别用硫代巴比妥法和酶联免疫吸附试验测定细胞培养液中丙二醛的含量和细胞间黏附分子1浓度:免疫化学法测人脐静脉内皮细胞核转录因子κB的表达:虎红染色法检测人脐静脉内皮细胞与中性粒细胞黏附.结果:①与对照组比较,缺氧/复氧组细胞培养液中丙二醛含量增多(P＜0.01);随着黄芪甲苷预处理剂量的增加,丙二醛含量降低(P＜0.01),呈剂量依赖性.②与对照组比较,缺氧复氧组人脐静脉内皮细胞核转录因子κB阳性细胞率、细胞培养液中细胞间黏附分子1浓度及中性粒细胞黏附率升高(P均＜0.01);随着黄芪甲苷预处理剂量的增加,核转录因子κB表达阳性细胞率、中性粒细胞黏附率下降(P＜0.05或P＜0.01),细胞间黏附分子1浓度减少(P＜0.01),呈剂量依赖性.结论:黄芪甲苷通过抑制缺氧复氧引起的血管内皮细胞核转录因子κB表达,减轻血管内皮细胞与中性粒细胞黏附,对缺氧/复氧损伤血管内皮细胞具有保护作用,且呈剂量依赖性.
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降钙素基因相关肽对高脂复合缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响
背景：前期研究表明，结扎冠状动脉可诱发大鼠传入神经纤维末梢逆向释放降钙素基因相关肽，提示降钙素基因相关肽参与了急性心肌缺血的病理生理过程。
目的：观察降钙素基因相关肽对氧化低密度脂蛋白孵育缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响。
方法：20孔原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为5组：正常对照组、氧化低密度脂蛋白组、氧化低密度脂蛋白+缺氧/复氧组、降钙素基因相关肽组和CGRP 8-37组。后4组均用氧化低密度脂蛋白孵育24 h，再建立心肌细胞缺氧/复氧模型；降钙素基因相关肽组在缺氧/复氧前30 min加入10-8 mol/L 降钙素基因相关肽，CGRP 8-37组在给予降钙素基因相关肽前30 min加入10-7 mol/L的降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP 8-37。采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率并测定caspase-3活性。
结果与结论：降钙素基因相关肽能明显抑制氧化低密度脂蛋白和缺氧/复氧处理的乳鼠心肌细胞caspase-3的激活，从而阻止凋亡的发生，并且该作用能被降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP 8-37部分逆转，说明降钙素基因相关肽通过与降钙素基因相关肽1受体结合产生抗凋亡效应，进而抑制心肌细胞凋亡，对氧化低密度脂蛋白孵育乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用。 -
钙敏感受体对乳鼠心肌细胞凋亡的诱导作用
探讨在缺氧/复氧所诱导乳鼠心肌细胞凋亡中，钙敏感受体（calcium - sensing receptor，CaSR）对Fas/Fas配体（Fas L）途径的影响。方法对8只2日龄Wistar大鼠心肌细胞进行原代培养，后随机分为三组：(1)对照组：细胞不经缺氧/复氧处理，在其他组复氧开始时培养基内加入与用药组等体积的生理盐水；(2)缺氧/复氧组：心室肌细胞缺氧2h/复氧24h，细胞培养基内于复氧开始时加入与用药组等体积的生理盐水；(3) CaSR激动剂氯化钆(GdCl3)组：细胞培养基内于复氧开始时加入300μmol/L CaSR激动剂GdCl3。流式细胞仪分析细胞凋亡率，透射电镜观察细胞超微结构，蛋白印迹法检测CaSR、Fas和FasL蛋白的表达。结果流式细胞仪检测显示,缺氧/复氧组心肌细胞凋亡为12.18％±1.54％,与对照组相比，心肌细胞凋亡明显增加(P＜0.01)。CaSR激动剂GdCl3使心肌细胞凋亡进一步增加至20.25％±2.87％ (P＜0.01)。透射电镜下可见线粒体絮状变、线粒体嵴溶解、空泡样变；CaSR激动剂使CaSR、Fas和FasL表达进一步上调，明显高于缺氧/复氧组(P＜0.05)。结论CaSR激活参与了缺氧/复氧所诱导的乳鼠心肌细胞凋亡，CaSR可通过激活Fas/FasL死亡受体途径导致乳鼠心肌细胞凋亡。
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钙敏感受体在缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡中的作用
目的 探讨钙敏感受体(CaSR)对缺氧/复氧(A/R)所诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响及其机制.方法 原代培养乳鼠心室肌细胞缺氧2 h/复氧24 h,建立A/R心肌细胞损伤模型.心肌细胞随机分为三组:对照组、A/R组和CaSR激动剂氯化钆(GdCl3)组.四氮唑嗅盐法(MTT)检测细胞的存活率,原位缺口末端标记法(TUNEL)分析细胞凋亡率,蛋白印迹法检测CaSR、半胱氨酸天冬酶(caspase)-3、9和细胞色素c(Cytc)蛋白的表达.结果 TUNEL染色显示A/R后心肌细胞凋亡为(17±3)%,与对照相比,心肌细胞凋亡明显增加,CaSR表达也增加.CaSR激动剂GdCl3使心肌细胞凋亡进一步增加至(28±4)%,MTT检测表明心肌细胞存活率仅为(51.2±6.8)%;CaSR、caspase-3、caspase-9和Cytc表达进一步上调,明显高于A/R组.结论 CaSR通过线粒体Cytc-caspase-3途径参与了A/R所诱导的心肌细胞凋亡.
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硫酸镁对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用
目的研究硫酸镁对纯化培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及其作用机制.方法采用培养乳鼠心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分为五组:正常对照组、缺氧/复氧损伤模型组、缺氧/复氧损伤+MgSO4(2.2、4.0、7.2mmol/L)组.分别用黄嘌呤氧化酶法测定细胞内SOD活性,硫代巴比妥酸法测定细胞内MDA含量,MTT染色法测定心肌细胞活力并测定培养液中LDH含量的变化.结果硫酸镁能显著提高细胞内SOD的活性,降低MDA、LDH的含量并可提高心肌细胞的活力.结论硫酸镁具有明显的抗缺氧/复氧损伤、保护心肌细胞的作用.
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苦参素对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞保护作用研究
目的:研究苦参素(Oxymatrine,OMT)对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞的保护作用.方法:于无菌环境下分离SD大鼠乳鼠心肌细胞并培养72 h后随机分为:空白对照组、缺氧/复氧(H/R)模型对照组、OMT(20、40、80μg/mI)干预组和舒血宁注射液(SXN,100 μg/mL)干预组(阳性对照组),每组设10个复孔.药物干预6h后,通过倒置光学纤维镜观察细胞形态;通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;检测细胞培养液中谷草转氨酶(AST)、磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)释放量;测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)含量;通过酶联免疫法(ELISA)测定培养液中TNF-α、IL-1、IL-6含量水平;通过流式细胞仪检测细胞凋亡状况并计算凋亡率,通过RT-PCR检测细胞中bcl-2mRNA、Bax rnRNA表达并计算bcl-2/Bax表达比值.结果:与模型对照组比较,OMT 40、80μg/mL干预组乳鼠心肌细胞形态和生存状态均明显好转,存活率显著升高,培养液中AST、CPK、LDH释放量显著降低,细胞中SOD活性显著升高且MDA含量显著降低,细胞凋亡状况显著改善、凋亡率显著降低,细胞中bcl-2 mRNA表达显著上调且Bax mRNA表达显著下调,bcl-2/Bax表达比值显著升高,培养液中TNF-α、IL-6含量水平显著降低,上述差异均具有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);其中OMT 80 μg/mL干预组细胞中GSH-Px活性显著升高(P＜0.05),培养液中IL-1含量显著降低(P＜0.05).结论:苦参素能够有效改善缺氧/复氧损伤心肌细胞形态、提高细胞存活率、改善抗氧化酶活性、抑制氧化应激损伤、降低细胞凋亡率、并抑制炎症反应,提示苦参素对缺氧/复氧损伤乳鼠心肌细胞具有保护作用.
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甘西鼠尾草对缺氧/复氧H9c2大鼠心肌细胞的保护作用
目的 探究甘西鼠尾草对培养H9c2大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及机制.方法 采用体外细胞培养方法培养乳鼠心肌细胞,建立缺氧/复氧损伤心肌细胞模型,用甘西鼠尾草进行细胞给药,干预细胞生长过程.将培养的H9c2大鼠心肌细胞随机分为6组,分别为缺氧/复氧模型组(hypoxia/reoxygenation,H/R组);正常对照组(control,C组);缺氧/复氧模型+维拉帕米(verapamil)阳性对照组(H/R+V组);缺氧/复氧模型+甘西鼠尾草低、中和高剂量(0.01、0.1和1.0 mg·L-1)干预组(H/R+L、M、H组).使用噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率;收集所培养的细胞上清液测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活性;使用荧光酶标仪,测定能够反映细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平高低的荧光吸光度值.结果 甘西鼠尾草可明显提高心肌细胞存活率,有效减少细胞内LDH漏出量和胞浆内MDA的含量,并降低细胞内ROS水平.结论 甘西鼠尾草对缺氧/复氧损伤心肌细胞具有显著的保护作用,其作用机制可能与其增强细胞清除氧自由基能力、减少脂质过氧化物的产生有关.
关键词： 甘西鼠尾草 H9c2大鼠心肌细胞 缺氧/复氧 -
脯氨酰异构酶1沉默抑制缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡
目的:肽基脯氨酰顺反异构酶1(Pin1)在心血管疾病发病过程中发挥重要作用,本研究检测RNA干扰沉默Pin1对缺氧/复氧诱导的大鼠胚胎心肌细胞H9c2凋亡的影响及机制.方法:体外培养大鼠H9c2细胞,建立缺氧/复氧损伤模型,模拟体内缺血再灌注损伤;RT-qPCR和Western blot法检测Pin1的表达;将细胞分为空白对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧组+转染Pin1 siRNA组、缺氧/复氧组+转染scramble siRNA组;MTT法测H9c2细胞存活率;用流式细胞术Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;用Western blot法检测H9c2细胞Bax和Bcl-2蛋白表达;生化法检测Caspase-3的活性水平.结果:Pin1在缺氧/复氧H9c2细胞中呈现高表达;转染Pin1 siRNA后,Pin1的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,Pin1 siRNA组的细胞存活率增加,凋亡率降低,Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,Bcl-2/Bax升高,Caspase-3活性降低,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:Pin1下调可减少缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,可能是通过上调Bcl-2,下调Bax蛋白表达,降低Caspase-3活性而发挥作用.
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硫氧还蛋白对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞的保护作用
目的 探讨硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)对缺氧/复氧损伤内皮细胞(ECV)的保护作用.方法 对体外培养的内皮细胞株ECV304(缺氧/复氧组)及TRX修饰的ECV304(TRX组)进行缺氧/复氧实验,另一组ECV304细胞不作缺氧/复氧作为正常对照组,检测复氧不同时间点细胞培养上清液中丙二醛(MDA)、内皮素-1(ET-1)及一氧化氮(NO)的含量变化.结果 正常对照(ECV304组),细胞内的MDA、ET-1及NO含量在24 h内变化不大；转染空载体的ECV304细胞在缺氧3h时,MDA、ET-1含量显著增加,复氧12 h时,MDA、ET-1含量达到高,然后缓慢下降；ECV304/Trx组与转染空载体组相比,在3h及12时,MDA含量极显著下降(P＜0.01),而在24 h MDA水平显著下降(P＜0.05).ET-1水平在复氧的各时间点均比有下降,在复氧24 h下降明显(P＜0.01)；转染空载体的ECV304细胞在缺氧3h时,NO含量显著下降,复氧12 h时,NO含量下降到低,然后缓慢上升；ECV304/Trx组与转染空载体组相比,在3h及12时,NO含量极显著上升(P＜0.01),在12 h NO水平高.ECV304/TRX组与正常对照组相比,在12 h时,有显著差异.结论 TRX能抑制缺氧/复氧对ECV的损伤,对缺氧/复氧环境下的ECV起保护作用.
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灯盏花素对缺氧/复氧大鼠心肌细胞凋亡及Stat1,3 mRNA表达的影响
目的 观察灯盏花素对缺氧复氧大鼠心肌细胞凋亡及其凋亡相关基因信号转导及转录激活因子Stat1,3 mRNA表达的影响.方法 用原代培养的乳鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型,随机分为4组,正常对照组,模型组、灯盏花素(25、50 mg/L)组,其中模型组、灯盏花素组进行缺氧2h再复氧4h.采用AnnexinV -PI双染,流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡情况；RT-PCR检测大鼠心肌细胞的Stat1,3 mRNA表达变化.结果 缺氧/复氧损伤后,与正常对照组比较,大鼠心肌细胞凋亡及Stat1 mRNA表达均增加(P＜0.01),Stat3 mRNA表达降低(P＜0.01)；灯盏花素组处理后,大鼠心肌细胞凋亡及Stat1 mRNA表达均减少(P＜0.05),Slat3 mRNA表达升高(P ＜0.05,P＜0.01).结论 灯盏花素上调凋亡抑制基因Stat3mRNA表达,下调凋亡促进基因Stat1 mRNA表达,从而抑制缺氧/复氧大鼠心肌细胞的凋亡.
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脑通汤含药血清对缺氧/复氧大鼠海马神经元抗氧化应激相关指标的影响
目的 探讨脑通汤通过海马神经元抗氧化应激治疗血管性痴呆(VD)的机制.方法 培养大鼠原代海马神经元及鉴定,取培养9d的神经元,随机分为正常细胞组、缺氧/复氧模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组.除正常细胞组以外,各组均置入(95％ N2 +5％CO2)混合气体的三气培养箱缺氧24 h再复氧2h造模.采用MTT法检测缺氧24 h和复氧2h时间点海马神经元活性并计算细胞存活率;实时荧光定量PCR法检测海马神经元核因子-E2-相关因子(Nrf)2、血红素氧合酶亚型(HO)-1、醌氧化还原酶(NQO)1 mRNA的表达.结果 MTT显示:缺氧24h:模型组的海马神经元活性及存活率较正常细胞组明显下降(P＜0.05),与正常血清组及脑通汤不同剂量含药血清组比较无明显差异(P＞0.05).复氧2h:脑通汤不同剂量含药血清组均较模型组明显升高(P＜0.05),正常血清组较模型组无明显差异(P＞0.05).实时荧光定量PCR结果显示:脑通汤含药血清能够促进缺氧/复氧海马神经元抗氧化应激相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达(P＜0.05),并且脑通汤含药血清大剂量组与中剂量组的上述3个基因水平明显高于缺氧/复氧模型组(P＜0.01).结论 脑通汤可通过上调抗氧化相关基因Nrf2、HO-1、NQO1的表达,减轻海马神经元缺氧/复氧损伤的氧化应激反应,从而保护大鼠海马神经元缺氧/复氧损伤.
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缺氧/复氧对体外培养星形胶质细胞脑源性神经营养因子合成及释放的影响
目的 观察缺氧/复氧条件下体外培养星形胶质细胞活力变化及脑源性神经营养因子(BDNF)释放和表达的变化.方法 采用原代培养的大鼠皮质星形胶质细胞,实验分为正常组(N)及缺氧/复氧组(H/R).在缺氧/复氧各个时间点,应用MTT法检测缺氧/复氧时培养星形胶质细胞的活力变化,应用Western blot检测BDNF的表达水平;ELISA检测星形胶质细胞条件培养液上清中BDNF的含量.结果 与对照组相比,在缺氧6h、复氧72 h以内体外培养星形胶质细胞,细胞活力不会发生明显改变,BDNF的释放量无明显变化,但是缺氧/复氧可诱导体外培养星形胶质细胞BDNF表达量的增加.结论 单纯的缺氧/复氧条件可影响体外培养星形胶质细胞BDNF的合成,但不足以引起BNDF的释放改变以及细胞的活力变化.
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高渗液对缺氧/复氧人脐静脉内皮细胞内游离钙离子浓度的影响
目的:观察高渗液(HS)对缺氧/复氧的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内游离钙离子浓度([Ca2+i)的影响,阐明高渗液治疗休克时对血管内皮细胞的保护机制.方法:体外分离和培养的HUVECs分为对照组和实验组,采用荧光探针技术,应用激光共聚焦显微镜,测定细胞内[Ca2+]i的变化,两组细胞先置于缺氧(95%氮气,5%CO2)环境中8 h,然后将实验组细胞置于配制好的HS中15 min,再在常氧状态下(95%空气,5%CO2)培养16 h.对照组细胞加对照液(M1 99培养液)15 min后同实验组.两组细胞分别于缺氧前(T0)、缺氧后(T1)、处理后(T2)、复氧后1/2、2、8、16 h(T3～6)测定细胞内Fluo-3荧光强度.结果:两组细胞荧光强度T1与T0比较显著升高(P<0.05);实验组细胞荧光强度T2低于实验组T1及对照组T2(P<0.05),但仍高于T0(P<0.05),且复氧过程中逐渐降低,至T5恢复到T0水平;两组细胞T3时点荧光强度均高于各T2时点(P<0.05);实验组复氧过程中不同时点(T3～6)荧光强度低于各自同一时间点的对照组(P<0.05).结论:缺氧/复氧可以引发HUVECs内[Ca2+]i升高,而HS能减轻HUVECs内的钙超载,保护缺氧/复氧损伤的内皮细胞.
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黄芪甲苷调控HO-1抗心肌细胞缺氧/复氧损伤作用研究
目的:研究黄芪甲苷抗乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤作用机制.方法:以乳鼠原代心肌细胞为研究对象,通过建立细胞缺氧/复氧(H/R)损伤模型,体外模拟心肌缺血再灌注损伤.应用MTT法测定细胞活力,Western blot检测血红素氧化酶1蛋白表达,并考察细胞培养液中cTnT、SOD、GSH-PX含量,以及炎症细胞因子hs-CRP、TNF-α浓度.结果:H/R损伤可诱导心肌细胞细胞活力下降,细胞上清中cTnT水平增高,SOD、GSH-PX水平下降,炎症细胞因子hs-CRP、TNF-α水平增高,伴随HO-1蛋白的表达上调;HO-1诱导剂CoPP可以显著抑制H/R损伤所致的细胞损伤及氧化平衡体系失衡、炎症细胞因子表达.黄芪甲苷可使HO-1表达进一步升高,具有类似CoPP效应,显著降低经H/R处理的心肌细胞cTnT水平,升高SOD、GSH-PX水平,降低炎症细胞因子hs-CRP、TNF-α水平.而HO-1抑制剂ZnPP则可以显著增加H/R诱导的细胞损伤作用.结论:HO-1通过抗氧化、抗炎作用参与抗心肌细胞H/R损伤,黄芪甲苷可能通过诱导HO-1表达而发挥抗H/R损伤作用.
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番茄红素对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧的保护作用以及其机制
目的:探讨番茄红素对心肌细胞缺氧复氧的保护作用以及其分子机制.方法:采用原代培养心肌细胞建立缺氧/复氧损伤模型,实验分8组:正常对照组,H/R组,H/R+番茄红素(1,2,4,8,16,32 μmol/L)剂量组.观察各组细胞经H/R损伤后,细胞内天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化情况,选择正常对照组,H/R组,佳番茄红素剂量组做MTT分析细胞凋亡,Western检测TRL4以及NF-K B的表达.结果:番茄红素(16,8,4,2μ mol/L)剂量组可显著降低缺氧/复氧损伤心肌细胞内AST、CK、LDH释放量及MDA的生成,并能提高SOD活性.此外番茄红素可减少心肌细胞缺氧/复氧损伤后的心肌凋亡,减少TRL4受体以及NF-k B的表达.结论:番茄红素具有抗缺氧/复氧损伤,保护心肌细胞的作用,其机制可能是通过抑制TRL4通路来实现的.
