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高致病性禽流感病毒性肺炎小鼠模型血清细胞因子的水平
目的 探讨细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在高致病性禽流感病毒性肺炎(HPAIVP)中的作用.方法 昆明小鼠60只随机分为实验组和对照组,每组30只.高致病性禽流感病毒滴鼻制备HPAIVP小鼠模型,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA),对攻毒后不同时间点实验和对照组小鼠血清IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α水平进行检测.结果 实验组血清IL-1β、IL-6、和TNF-α水平明显高于对照组,差异均有显著性(Pa＜0.05).结论 细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α参与高致病性禽流感病毒肺炎的发病过程.
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人感染H7N9亚型禽流感病毒分子生物学研究进展
2013年3月至今,我国多个省市地区发生了人感染H7N9禽流感疫情并引起较高的病死率,而从2016年秋季开始的第5波疫情显得尤为严重,这使得人感染H7 N9禽流感作为严重危害我国人民健康的重大急性传染性呼吸道疾病而备受关注.本文综述了近年来关于人感染H7N9亚型禽流感病毒在基因组进化及哺乳动物适应性突变方面的分子生物学研究进展,以期推动人感染H7N9禽流感防控策略的研究.
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一株鸽子源的H4N8亚型禽流感病毒的部分生物学特性
目的 实验室2017年对我国四川省遂宁船山区蜀中食品城进行流行病学调查时从鸽子体内分离鉴定出的一株H4N8亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)(A/Pigeon/Sichuan/S1185/2017(H4N8)(缩写为PG/SC/S1185/2017).方法 为了解此株从鸽子体内分离到的H4N8亚型AIV的遗传进化特点,对此株病毒进行了全基因组的测序并画出基因进化树来探索其毒株来源,还探究了该株病毒对哺乳动物的感染能力.结果 遗传演化分析数据表明,这株病毒株的各个基因节段分别来自于不同亚型流感病毒,基因来源复杂,是一株重组病毒,其具有明显的遗传多样性.小鼠感染性实验结果表明,该毒株仅能够在小鼠肺脏和鼻甲中产生微弱复制,在小鼠感染病毒3d后并未出现明显临床症状,小鼠活力没有明显的下降,与对照组相比体重变化其实基本相同.结论 为今后的流行病学调查中对H4亚型流感病毒的全面监测和综合预防防控提供了数据支持.
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一种敏感的H5禽流感病毒血凝抑制试验方法
目的 建立一种敏感的禽流感病毒血凝抑制方法检测H5禽流感病毒特异性抗体.方法 采用不同动物来源的红细胞,用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒特异性抗体,比较其灵敏性.结果 通过对鸡、豚鼠、马等动物红细胞的比较,发现在采用血凝抑制试验测定H5禽流感病毒抗体时马红细胞灵敏度高.结论 可以利用马红细胞建立测定H5禽流感病毒血凝抑制抗体的敏感方法,该方法可以用于人群中禽流感病毒血清抗体水平的调查.
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流感/禽流感病毒血凝素的分子遗传特征与其致病性
流感病毒是引起流行性感冒的病原,分为甲、乙、丙三型,其中以甲型流感对人类威胁大.自1918年的流感大流行夺走约4千万人生命以来[1],在1957年和1968年相继又发生了世界大流行.这三次大流行都是由于流感病毒变异出现新亚型而引起,即HIN1(1918),H2N2(1957),H3N2(1968)流感病毒新亚型.1997年香港18人感染禽流感H5N1亚型,6人死亡[2],首次突破人种属屏障,随着人感染禽流感病例的增多,发病地域扩大[3],引起了全球的担忧,敲响了防备新一轮大流行的警钟,掀起全球性防控流感的高潮.引起流感大流行的分子基础研究表明流感病毒的血凝素(HA)的变异起着重要作用.该文就流感病毒HA片段与其致病性的关系进行综述.
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流感病毒分子生物学研究进展
2003年底至2004年初韩国、泰国、日本、越南和我国相继暴发禽流感,越南、泰国出现了禽流感病毒感染人并致死的病例.经实验检测证实,此次流行的禽流感病毒为H5N1变异株,目前,从亚洲禽类分离出的H5N1病毒株变异迅速,在鸟类中出现大范围禽流感流行,增加了人类暴露的机会.随着感染人数增多,会增加禽和人流感病毒株的基因重组机会[1].由于流感病毒抗原的特异性,其变异株和疫苗的预防效果均密切关联.因此,对流感病毒变异的研究一直是国内外学者关注的热门课题.随着分子生物学技术的发展,人们早已开始从分子水平探讨流感病毒的变异机制及其流行规律,人类流感与动物流感的关系等方面的研究均已取得了重大进展.现将流感病毒基因组结构,病毒变异特性,病毒在不同宿主中的变异速度及其变异的分子基础等诸方面综述如下.
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禽流感流行特点及预防控制策略
近几个月以来,日本、越南、韩国、泰国、中国等亚洲10个国家或地区以及美国的特拉华州先后暴发了大面积的禽流感,数千万只家禽病死或被宰杀销毁;情况更为严峻的是,越南、泰国两国的禽流感病毒正以一种尚未完全清楚的途径向人类传播.而且,随着越来越多的家禽染病和死亡,患者的数量也在逐渐增加.
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流感大流行疫苗的研究进展评价
近年来高致病性禽流感病毒在亚洲许多国家的流行,加重了人们对流感大流行发生的担忧,疫苗作为控制流感大流行的一种主要手段,受到各个国家的重视.自1997年开始人们研究可能用于流感大流行使用的各种疫苗,全文拟对近年来世界上流感大流行疫苗的研究进展进行总结,其目的在于为我国流感大流行的准备应对工作,特别是疫苗的应对措施提供启示.
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鸡瘟--禽流感--人禽流感
去年12月韩国发生禽流感以来,东亚及东南亚各国和地区相继也发生了禽流感疫情,越南和泰国还出现了人感染禽流感病毒而死亡的病例.非典未除,禽流感紧随而来,不免会使人产生心理恐慌而"谈禽色变"有不少人连鸡肉都不敢吃了.那么,禽流感是何方妖孽,如此引起世人关注.
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日本认为禽流感的传染源可能是野鸟
日本农林水产省官员9日说,动物卫生研究所从京都府丹波町和邻近的园部町发现的两只死乌鸦身上鉴别出H5N1型禽流感病毒,证明野鸟可能是禽流感传染源.
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H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达
根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物.自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa.分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明:重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性.
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网状内皮增生病病毒感染SPF鸡对疫苗免疫反应的抑制作用
我国鸡群中网状内皮增生病病毒(REV)感染已相当普遍,但对其造成的实际危害却不太清楚.本研究结果表明,1日龄SPF鸡感染REV会显著抑制对新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV,H5和H9)疫苗的免疫反应.1周龄用相应灭活疫苗免疫后3周、4周和5周,REV感染组对不同病毒疫苗免疫后的HI效价显著低于对照组.高剂量REV感染组的抑制作用大于低剂量感染组,但统计学差异不显著.REV感染可造成中枢免疫器官萎缩,REV感染组的胸腺、法氏囊与体重比显著低于对照组.本研究证明了,REV早期感染会干扰鸡群对NDV、AIV的免疫效果,特别是会严重干扰对AIV疫苗的免疫效果.
关键词： 禽网状内皮增生病病毒 新城疫病毒 禽流感病毒 免疫抑制 -
我国H7N2亚型禽流感病毒CK/HB/1/02株分离鉴定
从鸡组织中获得了一株分离物,能凝集鸡红细胞,经负染后电镜观察可见球形、外被囊膜的病毒颗粒,直径约90～100nm;经血凝抑制和神经氨酸酶抑制试验鉴定为H7N2亚型禽流感病毒(Avian in fluenza virus,AIV),命名为A/Chicken/Hebei/1/2002(H7N2)(简称CK/HB/1/02).将该病毒接种SPF鸡,测得静脉接种致病指数(IVPI)为0.00,剖检可见实验鸡多种组织器官有出血性变化,判为低致病力AIV;接种后7d从实验鸡泄殖腔棉拭中回收到病毒,并在血清中检测到H7亚型AIV抗体.经RT-PCR扩增了病毒HA1基因片段(约1.1kb),测定其核苷酸序列并与GenBank中的序列比较.结果表明,该病毒的HA1基因序列与AIV标准株A/Afri.Star./Eng Q/79(H7N1)的HA1基因同源性高,为99.4%;与以色列和意大利H7N2AIV的同源性较高,为96.8%～98.2%;与美国H7N2病毒的同源性很低,约为81.0%;其HA裂解位点的氨基酸序列为KGR-GLF-,符合低致病力AIV的特征.
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共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究
用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照.免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况.免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数.试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA.重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10/10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9/10,与常规疫苗相当.免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况.结果表明,rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒.rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响.
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禽流感病毒M1蛋白的表达及其免疫反应性分析
根据已发表的禽流感病毒M1基因序列设计合成PCR克隆引物,自接种H5N1亚型病毒的鸡胚组织中提取RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTM DNA Polymerase)经PCR扩增M1基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组蛋白,分子量约29.8 kDa.采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、阻断ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性.结果发现:重组M1蛋白能与单克隆抗体和阳性血清发生特异性结合,且此结合能被天然病毒抗原阻断.研究表明:重组蛋白M1具有良好免疫反应性.
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H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别
建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究.参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp.经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应.敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带.结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型.另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力.
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H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录/表达载体的构建和验证
设计带有BsmBI、BsaⅠ或AarⅠ酶切位点的引物,用RT PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签.将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3+5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2 AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础.
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整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒
本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.
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一种抗AIV共有独特型抗体具有AIV血凝素分子的内影象
用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)IgG作免疫原,通过单克隆抗体技术制备出1株分泌针对鸡抗AIV和兔抗AIV共有独特型抗体的杂交瘤细胞.竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明,此抗体具有AIV血凝素分子的内影象.
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一株H5N1亚型禽流感病毒的分离与鉴定
2004年1月湖北宜昌某鸡场暴发疫病,从该鸡场濒死鸡肺组织中分离到了一株病毒,电镜切片观察到典型的禽流感病毒粒子;采用ELISA检测禽流感抗原为阳性;RT-PCR扩增HA、NA基因并测序,经BLAST分析,HA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)HA基因同源性为97%;NA基因与A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)NA基因同源性为96%,确定该分离株为禽流感病毒H5N1亚型(A/Chicken/Yichang/Lung-1/04(H5N1)).
