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一株水禽流感病毒分离株表面膜蛋白基因的序列分析
禽流感(Avian Influenza,AI)是由A型流感病毒所引起的各种家禽及野生禽类感染和/或疾病综合征[1].根据其表面糖蛋白血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)和神经氨基酸酶(Neuraminidase,NA)的抗原关系不同,目前可分为16种HA亚型和9种NA亚型[2,3].近几年来,南亚国家屡有禽流感病毒突破种间屏障作用,直接感染人类或其它哺乳动物,甚至致人死亡事件[4～6]的情况发生,因而赋予了禽流感全新的公共卫生学意义.因此,准确的了解和把握水禽,尤其是家养水禽的流感生态,对预防禽流感的发生具有非常重要的现实意义.为了防患于未然,近年来扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室,对我国华东地区的家养水禽带毒情况进行了两年多的监测,分离到多株H11亚型,迄今国内极少见该亚型报道.本文就国内家养水禽中分离株Dk/YZ/44/02(H11N2)的表面膜蛋白基因序列进行了测序和序列分析.
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禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科流感病毒属的成员.AIV核酸为单链线状分段RNA,病毒表面囊膜上镶嵌着两种重要纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA).HA和NA与病毒的毒力、传染性密切相关.其中ha基因是重要的免疫原性基因,它刺激机体所产生的抗体可中和病毒、抵抗感染,同时,由于AIV基因组中ha基因极易发生变异,故对ha基因的研究已成为目前研究AIV的热点.我们已成功克隆了禽流感ha基因的部分片断,并对其分子特性作了初步研究,现报告如下:
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防治跨种属的禽流感
易发于野生鸟类和家禽中流行的禽流感病毒可引起禽流感(avian influenza).禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属.预防禽流感要加强禽类疾病的监测.对疑似和确诊患者应进行隔离治疗和对症治疗,加强支持治疗,密切观察,监测并预防并发症的发生.
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基因重组疫苗的研究进展
血凝素是流感的保护性抗原,它不仅诱导机体产生针对血凝素1和血凝素2的抗体,而且诱导CTL反应.1.2.1 左青山等[1]构建了禽流感(AIV)血凝素5和血凝素9基因共表达禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的血凝素基因重组禽痘病毒,可表达AIV的血凝素5和血凝素9基因.用该重组禽痘病毒免疫鸡后再用禽流感病毒做攻击试验,结果表明该重组病毒能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应,对H5强毒攻击产生强的免疫保护,为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础.
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嘉兴市外环境禽流感病毒污染状况及职业暴露人群H5N6、H7N9和H9N2抗体水平调查
目的 了解嘉兴市外环境禽流感病毒分布情况及涉禽职业暴露人群禽流感病毒感染现状,为科学有效防控人感染禽流感疫情提供科学依据.方法 实时荧光定量PCR检测2013年3月-2016年4月采集的嘉兴市3 115份外环境标本的A型流感病毒核酸,并对A型流感病毒核酸阳性的标本进一步进行H5、H7、H9亚型检测.采用马血红细胞凝集抑制试验检测2015年4月和2016年4月采集的嘉兴市140名涉禽职业暴露人群血清中的H5N6、H7N9和H9N2血凝素抗体.结果 外环境标本中A型流感病毒核酸阳性率为18.11％,H5、H9、H7亚型阳性率分别为0.64％、3.21％、5. 07％;同时,外环境标本中检出不同亚型混合污染标本74份,且H9/H7混合污染的阳性率达到1.86％.A型流感病毒及H7亚型阳性率在冬春季节出现高峰,且在城乡活禽市场的阳性率明显高于其他场所;宰杀或摆放禽肉案板表面和清洗禽类的污水标本中A型流感病毒及H7亚型的阳性率明显高于其他标本类型.140份人群血清标本共检出H9N2抗体阳性标本5份,阳性率为3.57％,未检出H5N6、H7N9抗体阳性标本.结论 2013-2016年嘉兴市外环境中存在H5、H9、H7亚型污染,且涉禽职业暴露人群中少量的H9N2禽流感病毒无症状感染者,提示禽类接触、活禽交易市场暴露有感染禽流感病毒风险,因此应做好重点人群的健康教育及重点区域的禽流感病毒监测,防止人感染禽流感疫情的发生.
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深圳市龙岗区活禽市场外环境流感病毒污染监测及休市措施效果评价
目的 通过对活禽市场外环境监测,评估不同管理措施对控制禽流感病毒污染的效果.方法 2014年12月-2015年2月,在深圳市统一休市前后,采集龙岗区8个街道16个活禽市场的外环境标本,采用RT-PCR法进行A型、H5亚型、H9亚型、H7亚型和H7N9流感病毒核酸检测;并对深圳市休市后一个月内全市人感染H7N9禽流感病例发病情况与广东省其他地区进行比较.结果 共检测215份活禽市场外环境标本,检出A型流感病毒核酸阳性138份(64.19％);其中H9、H5、H7亚型流感病毒核酸阳性分别为37份(17.21％)、24份(11.16％)和3份(1.40％,含1份H7N9禽流感病毒核酸阳性);不同类型的外环境标本中不同的A型(x2=23.354,P=0.000)及H5(x2=10.609,P=0.005)亚型流感病毒核酸检出率有所不同;统一休市10 d后,深圳市1月内新发病例构成(6.67％)显著低于同期广东其它未休市地区的新发病例构成(46.55％)(x2=8.018,P=0.005),活禽市场外环境中A型流感(x2=48.337,P=0.000)和H9亚型(x2=6.509,P=0.011)污染率显著下降;“活禽零存栏”措施可以有效降低活禽市场外环境中A型流感病毒的污染率(x2=5.465,P=0.019).结论 龙岗区活禽市场外环境存在一定的禽流感病毒污染,“禁止活禽过夜和统一休市”作为现阶段防控人感染H7N9禽流感疫情的主要措施是科学、有效的.
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H5N1禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因在杆状病毒中的共表达
目的 构建共表达H5N1禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白的杆状病毒表达系统.方法 利用PCR方法分别扩增A/Hubei/1/2010(H5N1)病毒的HA和NA基因,克隆至经改造带有对虾白斑综合病毒(wSSv)早期启动子iel的mpFastBac Dual载体,构建mpFast Bac-HA-NA表达质粒,转化DH10Bac感受态细胞,用获得的Bacmid-HA-NA穿梭质粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒Bac-HA-NA;提取重组杆状病毒Bac-HA-NA的DNA并使用PCR方法检测;利用Western blot检测HA和NA表达,并分别检测重组杆状病毒Bac-HA-NA红细胞凝集能力和神经氨酸酶活性.结果 经PCR鉴定,构建的质粒Bacmid-HA-NA正确;Western blot检测表明Bacmid-HA-NA能在sf9细胞中有效表达HA和NA蛋白,生物活性检测表明Bac-HA-NA能引起红细胞凝集并具有神经氨酸酶活性.结论 获得了能同时表达禽流感病毒HA和NA的重组杆状病毒Bac-HA-NA,为进一步研究流感疫苗奠定了基础.
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2012年郧县家禽屠宰点从业人员及外环境禽流感监测结果分析
目的 了解郧县家禽屠宰点从业人员禽流感H5N1感染及外环境禽流感病毒H5、H9亚型污染状况.方法 1月份采集家禽屠宰点从业人员16人血清标本用红细胞凝集抑制试验(HI)检测H5N1抗体;1-12月每月各采集5份外环境鸡笼、鸡粪、污水标本用荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测禽流感病毒FluA、AH5、AH9、AN1核酸.结果 16份家禽屠宰点从业人员血清H5N1抗体均为阴性;家禽屠宰点60份外环境标本中,阳性检出(率)分别为FluA 30份(50.00％)、AH9 19份(31.67％)、AH51份(1.67％)、AN1 1份(1.67％);30份FluA阳性标本中,仅AH9阳性18份,构成比为60.00％;AH9、AH5全为阴性11份,构成比为36.67％;AH9、AH5同时阳性1份,构成比为3.33％;FluA、AH9、AH5、AN1在11月同一份污水标本中检出.结论 郧县家禽屠宰点外环境存在禽流感病毒AH9、AH5等多种亚型污染,且存在H5N1的污染,但没有从业人员感染H5N1的证据.
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2013年湖北省十堰市禽类职业暴露人群及外环境禽流感病毒监测分析
目的 了解湖北省十堰市禽类职业暴露人群H5N1亚型感染情况以及外环境禽流感病毒FluA、H5、H9、N1污染情况,为疫情防控和开展疫情风险评估提供依据. 方法 对十堰市2013年118份职业暴露人群血清检测H5N1抗体,对171份禽类外环境标本进行FluA、H5、H9、N1核酸检测. 结果 36份规模化家禽养殖场从业人员和14份活禽市场从业人员血清H5N1抗体均为阴性,68份规模化禽类加工厂从业人员血清中18份H5N1抗体阳性,阳性检出率26.47％.外环境标本中,规模化养殖场未检出FluA,活禽市场FluA、H5、H9、N1平均检出率分别为45.95％、16.22％、42.34％、13.51％,H5、N1同时阳性15份,H5N1检出率13.51％.活禽市场FluA、H5、H9不同类型标本阳性率范围分别为:29.73％ ～ 62.22％、5.41％ ～26.67％、24.32％ ～57.78％;污水的FluA、H5、H9阳性率均高于禽粪和禽笼,差异有统计学意义(x2=8.648,P =0.003;x2=6.369,P=0.012;x2 =8.150,P=0.004). 结论 十堰市规模化禽类加工厂和活禽市场为人感染禽流感的高风险场所,应重点加强外环境和职业暴露人群的监测.
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宁乡县家禽养殖环境禽流感病毒监测分析
目的 对宁乡县家禽养殖环境进行禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)监测,了解环境中AIV的分布状况.方法 2010年从3个禽类环境监测点(家禽散养户、规模化养殖交易场所和规模化养殖场)共采集环境标本80份,real-time PCR方法检测环境标本(污水、禽类粪便和禽类笼具表面涂抹标本)AIV核酸.结果 监测数据显示,80份环境标本中检出20份AIV核酸阳性,阳性率为25％；17份H5亚型AIV阳性,阳性率21.25％.家禽散养户H5亚型AIV核酸阳性率高,阳性率为30％,其次为规模化养殖交易场所和规模化养殖场,阳性率分别为23.33％和13.33％;不同环境标本H5亚型AIV标本检出率不同,其中污水标本阳性率高,阳性率41.67％,显著高于粪便和笼具涂抹样的阳性率.结论 宁乡县家禽养殖环境标本中H5亚型AIV核酸阳性率较高,各监测点需要及时对环境进行清扫和消毒,以减少H5亚型AIV传播至人的风险.
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H9N2禽流感病毒研究进展
H9N2亚型禽流感病毒在世界范嗣内广泛存在,它是当前禽流感流行的主要型别之一,呈地方性流行、持续存在等特征,严重危害我国养禽业的发展,给养禽业造成巨大的经济损失,1998年我国曾发生的H9N2亚型流感病毒感染人的事件更引起了人们的关注.本文就禽流感病毒的相关分类、病原学特征以及H9N2亚型禽流感病毒的流行特点、疫苗制备和实验室检测等方面的研究进展进行了综述.
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2011年郧县禽流感高危职业人群及外环境监测结果分析
目的 了解郧县禽流感高危职业人群H5N1感染及外环境禽流感病毒H5、H9亚型污染状况. 方法 2011年1-3月采集从事家禽养殖、屠宰等100人血清标本用红细胞凝集抑制试验(HI)检测H5N1抗体；1、4、7、10月每月各采集10份外环境鸡笼、鸡粪、污水标本用荧光定量PCR法(Real- time PCR)检测禽流感病毒FluA、AH5、AH9、AN1核酸. 结果 100份高危职业人群血清H5N1抗体均为阴性；家禽养殖户11份外环境标本FluA、AH5、AH9、AN1核酸均为阴性；家禽屠宰点29份外环境标本中,阳性检出(率)分别为FluA 10份(34.48％)、AH58份(27.59％)、AH9阳性4份(13.79％)、AN1 1份(3.45％),1份污水标本中AH5、AN1阳性. 结论 郧县家禽屠宰点外环境存在高致病性禽流感病毒(H5N1)污染,家禽屠宰点为人感染禽流感的高风险场所.
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禽流感来袭,护士准备好了吗?
越南护士感染病毒据越南卫生官员2005年3月7日说,一名负责照顾禽流感患者的护士被发现感染禽流感病毒,目前不清楚他是否是受患者感染而患病.
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人感染H7N9禽流感26例临床特征与病毒基因分析研究
目的：探讨人感染 H7N9禽流感病毒患者的流行病学和临床特征，以及病毒分子生物学特征。方法收集湖南省2013、2014年确诊的26例人感染 H7N9禽流感病毒患者的资料，对人和禽分离的 H7N9病毒进行鉴定和测序分析。结果26例患者中，发热和咳嗽是常见的起病症状，所有患者均存在肺炎；20例（76．92％）出现急性呼吸窘迫综合征（ARDS），25例（96．15％）初诊时白细胞下降或正常，发病至开始进行抗病毒治疗的平均时间为10 d。10例死亡，病死率达38．46％。患者分离的 H7N9病毒株测序分析表明，发生了H7基因Gln226Leu和Gly186Val替换，PB2基因Asp701Asn突变。结论急性呼吸系统损害是人感染 H7N9禽流感的主要临床表现，活禽暴露是人感染 H7N9禽流感的重要危险因素，H7N9禽流感病毒基因发生了部分位点的适应性突变，更容易从禽类向人跨种传播引起人类严重疾病，需加强病原学监测。
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禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达
目的 研究H5 I151F和H5 I151F+A134V+E186D两种氨基酸变异对血凝素蛋白(HA)亲人受体结合的影响,并获得该HA.方法 构建载体pRB21',共感染/转染vp37-牛痘病毒vRB12和pRB21',基因同源重组牛痘病毒表达HA,Western免疫印迹法鉴定.结果 获得了克隆有H5 HA全长基因片段的载体pRB21',构建了2种重组牛痘病毒re-W H5 I151F和re-VV H5 I151F+A134V+E186D,且能在被感染细胞膜表达这两种HA.结论 首次通过构建重组牛痘病毒成功表达了禽流感病毒H5N1的H5 HA,为进一步研究禽流感病毒人传人的可能性奠定了基础.
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禽流感H9N2型病毒致BALB/c小鼠感染模型的建立与研究
目的 建立H9N2型禽流感病毒BALB/c小鼠模型.方法 从江苏某农场新分离得到禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2),以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法对该病毒的HA、NA基因进行鉴定和测序以确证.病毒经狗肾传代细胞(MDCK)3次单克隆纯化,之后肺对肺传代感染BALB/c小鼠,通过体重丢失、死亡率、半数致死量(LD50)评价病毒的感染性和模型的建立.结果 A/Chicken/Jiangsu/07/2002(H9N2)型禽流感病毒通过肺对肺传代能感染小鼠,并且毒性逐渐增强,4次传代后能使小鼠致死,10次传代后病毒的LD50为10-2.17.结论 H9N2型禽流感病毒能在实验条件下感染哺乳类,并建立了研究禽流感病毒的BALB/c小鼠模型.
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H7N9禽流感病毒疫苗及其预防控制
禽流感病毒有6个内部基因来自于 H9N2，部分血凝素（hemagglutinin，HA ）和神经氨酸酶（neuramidinase，NA ）基因源自 H7N3和 H1N9。禽流感病毒能够感染人类，可能与 HA 和 NA 基因发生了 Q226L 和 E627K 关键位点突变有关，这两个突变被认为是病毒适应人类气道上皮的表现。此外，H7N9具有哺乳动物流感病毒的特性，如 HA 蛋白与哺乳动物细胞器结合，PB2蛋白基因突变等［1］。人类感染后缺乏特异性临床表现，很难早期诊断，患者死亡的原因多为多器官功能衰竭综合征和单纯急性呼吸衰竭。虽然临床观察认为神经氨酸酶抑制剂可能具有抑制 H7N9病毒复制的能力，但是目前无大规模临床资料证实其疗效确切。本文就人感染禽病毒疫苗及预防控制的研究作一综述。
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高通量测序H6N6亚型禽流感病毒及遗传进化分析
目的 对2013年在广东地区活禽交易市场外环境中分离到的2株H6N6亚型禽流感病毒株进行全基因组测序和遗传进化分析,为广东地区外环境禽流感病毒监控提供实验数据.方法 应用Ion Torrent对2份样本[A/Environment/Guangdong/SW-C 12382070/2013 (H6N6)和A/Envi-ronment/Guangdong/SW-C12382099/2013 (H6N6)]进行高通量测序,然后采用分子生物学软件对测序结果进行序列分析.结果 BLAST结果显示,2株毒株血凝素蛋白(HA)基因裂解位点附近序列均为P-Q-I-E-T-R-G,仅含有1个碱性氨基酸,是典型的低致病性禽流感病毒特征序列.2株毒株的HA基因与越南分离株A/duck/NhaTrang/60/2013 (H6N6)相似性高,神经氨酸酶(NA)基因与湖南分离株A/chicken/Hunan/S4495/2010(H6N6)相似性高.全基因组序列遗传进化分析结果显示,2株毒株的8个基因片段均属于欧亚谱系的禽源进化分支,其中HA基因属于ST2853-like分支,NA基因属于ST192-like分支,核蛋白(NP)基因属于HN573-like分支,碱性聚合酶2(PB2)、碱性聚合酶1(PB1)、酸性聚合酶(PA)、基质蛋白(M)和非结构蛋白(NS)基因属于ST339-like分支.结论 本研究中的2株H6N6亚型禽流感病毒株为同一亚型不同基因群间基因交换的重组病毒.
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禽类流感病毒实验室分析
流行性感冒(流感)是第一个实行全球性监测的病毒性急性呼吸道传染病,由于流感病毒抗原的易变性,目前尚无法完全加以控制.它不仅严重危害人类的身心健康,甚至可以夺走人的生命.自1997年香港报告H5N1禽流感可感染人后,更证实禽在流感大流行株的起源作用.为此,1998～2000年广东省设立8个流感监测市对禽(鸡)进行流感监测,分离鉴定禽类流感与人流感病毒,并进行H9N2禽流感病毒的抗原分析.现将研究结果报告如下.
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广东省1999年流感实验室监测结果分析
流行性感冒(以下简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,由于流感病毒抗原性不断变异,以致目前全世界还未能有效地控制该病.1997年香港A(H5N1)流感病毒引起的流感暴发,1998年我省首次在人群中分离到A(H9N2)流感病毒,证实了禽流感病毒能感染人,显得更有必要加强流感监测的重要性.现将广东省1999年的流感实验室监测结果分析如下.
