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定量聚合酶链反应检测HBV DNA的初步研究
对乙型肝炎病毒感染的诊断，通常是检测乙肝五项以及采 用常规定量聚合酶链反应(PCR)方法检则HBV DNA。近年来，定量PCR方法已经用于临床，为 精确检测病毒含量提供了灵敏的指标。我们采用定量PCR方法检测了33例乙型肝炎病人的39 份血清的HBV DNA，并与定性PCR方法进行了比较，现将初步结果报告如下。1 材料与方法1.1 临床资料 33例病人为我院1997年6月至1999年10月住院的乙型肝炎病人，其中男性29例，女性4例，年 龄21～68岁。诊断符合1995年第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方 案。临床类型包括急性肝炎7例，慢性肝炎23例，亚急性重型肝炎1例，肝炎后肝硬化2例。3 3例病人共采集39份血清标本。乙型肝炎抗原抗体系统五项指标中至少有两项异常。1.2 主要试剂
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应用荧光定量聚合酶链反应检测血清、肝组织中HBV-DNA含量观察HGV感染对慢性乙型肝炎HBV复制的影响
目的探讨庚型肝炎病毒(HGV)感染对慢性乙型肝炎(CH-B)患者乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响.方法应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、过氧化物酶与抗过氧化物酶复合物(PAP)法免疫组织化学、荧光定量PCR(FQ-PCR)技术对56例CH-B患者血清HGV-RNA、肝组织HGV-Ag、血清及肝组织中HBV-DNA含量分别进行了检测,并将血清HGV-RNA与肝组织HGV-Ag的表达、HGV-RNA,HGV-Ag阳性与阴性患者HBV-DNA含量进行了对比研究.结果血清HGV-RNA、肝组织HGV-Ag阳性分别为8例(14.3%)、10例(17.9%).血清HGV-RNA阳性与肝组织HGV-Ag表达显著相关(P<0.01),但部分肝组织HGV-Ag阴性患者亦有血清HGV-RNA表达.血清HGV-RNA、肝组织HGV-Ag阳性与阴性患者血清及肝组织中HBV-DNA含量均无显著性差异(P>0.05).结论 HGV感染对CH-B患者HBV复制无影响.肝脏是HGV的复制场所,但可能亦有肝外组织器官中复制.HGV至多具有微弱的致病性,但仍然需要进一步研究.
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定量聚合酶链反应检测肝病患者血清HBV DNA及治疗意义
本文采用定量聚合酶链反应(PCR)检测了327例乙型肝炎及肝癌患者血清HBV DNA含量和部分病例治疗前后其含量的变化.结果显示,慢肝组＞急肝组,且均明显高于肝硬化组,肝癌组与肝硬化组相似;HBeAg(+)组血清HBV DNA含量明显高于HBeAg(-)组;血清HBV DNA含量与黄疸及转氨酶无关.特异性过继细胞免疫疗法治疗后完全反应者、部分反应者及无反应者其血清HBV DNA含量变化不同.结果表明:血清HBV DNA含量高低与肝炎疾病进展程度呈一定的相关性,而与肝细胞损伤程度无关;定量检测HVC DNA含量是评价特异性过继细胞免疫疗法疗效的重要指标之一.
关键词： 乙型肝炎 肝癌 定量聚合酶链反应 特异性过继细胞免疫疗法 -
磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量
目的 利用磁珠分离法结合定量PCR技术,建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证及初步应用.方法 通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定,根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析.对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证,并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定.结果 该方法检测CHO细胞DNA残留的低准确定量浓度可达1×10-3 pg/μl,DNA含量在1×10-3 ～ 102 pg／μl范围内曲线线性良好,标准曲线的相关系数为0.994;该方法能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属的DNA无扩增反应;该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在90％以上,3次测定的相对标准偏差均小于20％,92.6％加标样品的DNA回收率在70％～130％之间;该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100 pg／剂量,符合《中国药典》三部(2010版)有关CHO细胞残余DNA的要求.结论 磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定.
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磁珠法结合定量PCR检测肠道病毒71型灭活疫苗中宿主细胞DNA残留量的验证及应用
目的 对磁珠法结合定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测肠道病毒71型灭活疫苗(Vero细胞)(EV71疫苗)中宿主DNA残留量进行适用性验证及应用.方法 利用微磁珠与蛋白溶液中DNA的特异性结合,来提取样品中残留的宿主细胞DNA.将已知浓度的细胞DNA对照系列稀释后,作为标准品DNA与提取的DNA同时进行qPCR扩增.根据标准品DNA的循环阈值与浓度之间的线性关系,对未知样品中残留DNA进行定量分析.结果 标准品检测范围在0.03～3 000.00 pg/反应.该方法的标准曲线决定系数≥0.980,扩增效率为90.0％～110.0％.质控样品回收率为50％～150％,相对标准偏差均小于30％.实验结果的各项参数均在要求范围内.结论 磁珠法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点,qPCR能够简便、快速、准确地对EV71疫苗生产过程中的DNA残留量进行定量测定.该法适用于EV71疫苗中DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他采用同样细胞基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义.
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乙型肝炎病毒DNA含量与血清标志物的关系
目的探讨乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量与乙肝血清标志物关系.方法采用定量聚合酶链反应(PCR)法检测354例乙型肝炎患者血清中DNA含量,与HBV标志物作对比研究.结果血清HBeAg阳性组HBV DAN含量明显高于抗-HBe或抗-HBc阳性组,而后两组HBV DNA检出率仍较高.乙型肝炎肝硬化组阳性率明显低于慢性乙型肝炎组,且含量较低.结论定量PCR法检测HBV DNA具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解病毒复制情况,制定治疗方案及疗效观察提供了确切依据.
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实时荧光逆转录定量聚合酶链反应甄别活性幽门螺杆菌方法的建立
幽门螺杆菌(Hp)感染与慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤等多种消化系统疾病具有密切的关系[1-2].Hp生长缓慢,通常在微需氧条件下要3～7 d甚至更长时间才能形成针尖状小菌落,且对培养条件要求较高,因此给临床消化道疾病确诊带来很大麻烦.Hp的检测方法目前已有尿素酶试验、细菌培养、活检标本切片染色、聚合酶链反应(PCR)及免疫学方法等[3].
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出生后不同发育阶段大鼠睾丸uPA/uPAR基因表达的变化
目的:为探讨uPA/uPAR系统在大鼠精子发生中的作用,研究出生后不同发育阶段大鼠睾丸组织中uPA/uPARmRNA表达的变化.方法:分别取出生后0、5、10、15、21、28、35、42、49、56天大鼠的睾丸组织,用实时定量聚合酶链反应法(PCR)检测各年龄组uPA/uPAR mRNA的表达变化.结果:除了出生后0天外,在其它大多数时间点uPA与uPAR mRNA表达趋势很相似.在出生后0天,大鼠睾丸组织中uPAR mRNA表达水平相对来说高于uPA mRNA表达水平,后逐渐减少,在出生后21天表达水平低,到28天急剧增加,35天到达高峰,42天迅速下降,之后维持一个低表达水平.结论:uPA/uPAR系统可能通过调节生精细胞迁移及增殖、促进精子排放及残余胞体从成熟精子中脱落等方式与精子排放和精子发生密切相关.
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慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV DNA载量相关因素分析
目的 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者肝组织HBV DNA载量和血清及外周血单个核细胞(PBMC)内病毒载量、肝组织炎症活动度(G)、纤维化分期(S)、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)等的相关性.方法 50例CHB患者均接受肝活检.部分肝组织行常规病理检查,另应用荧光定量PCR定量检测部分肝组织、PBMC与血清中病毒载量.同时检测患者血清ALT水平.结果 直线相关分析显示,肝组织中与血清中病毒载量高度正相关(r=0.77977,P＜0.0001);与PBMC中病毒载量中度正相关(r=0.53855,P＜0.0001).另外与血清ALT水平呈低度正相关,与肝组织G、S无明显相关性.逐步回归分析方程为Y=0.54960 X1+0.83890X2-0.36643X3+0.00174X4(Y:肝组织病毒载量;X1:血清病毒载量;X2:PBMC中病毒载量;X3:纤维化分期;X4:血清ALT水平).结论 CHB患者血清中和PBMC中病毒载量可用于推测肝组织中病毒载量水平.
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不同标本对荧光实时定量PCR法测定HBV-DNA结果的影响
目的利用沉淀煮沸裂解法提取HBV核酸,探讨不同的临床标本和贮存条件对荧光定量PCR法测定乙型肝炎病毒核酸(HBV-NDA)结果的影响,为临床标本的收集和贮存提供依据.方法按不同要求收集特定的临床标本,用本实验室使用的HBV-DNA提取方法提取DNA模板,再用荧光实时定量PCR法检测HBV-DNA的含量.结果经EDTA、中等含量肝素、枸橼酸钠抗凝血浆标本与相应血清标本测定HBV-DNA的含量无显著性差别均(P＞0.05),但高浓度肝素(1000U/ml)抗凝管结果显著降低(F值为25.96;P＜0.05);溶血、高血脂标本、标本反复冻融、血浆(清)标本在室温下短期贮存(48h内)对HBV-DNA含量均无明显影响(P＞0.05).结论用本实验室使用的HBV-DNA提取方法,可使抗凝剂及其它PCR反应抑制物质对HBV-DNA测定结果影响降到低,从而使临床无污染标本一般均可接受.
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Amplisensor PCR定量测定血清中乙型肝炎病毒核酸
我们用信号引物能量转移法(Amplisensor PCR)定量检测了乙型肝炎患者血清中HBV DNA,并与HBV血清标志物(HBV M)关系作一比较.
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乙肝患者血清HBV DNA含量与sIL-2R、TNF水平关系的研究
目的探讨乙型肝炎(乙肝)病毒数量在乙肝发病中的作用.方法分别用竞争性聚合酶链反应技术、双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)和放射免疫分析法(RIA),检测241例各型乙肝患者和20例正常人的血清HBV DNA浓度、血清可溶性白细胞介素2受体(sIL-2R)和肿瘤坏死因子(TNF)水平,进行相关分析.结果急、慢性乙肝患者血清HBV DNA浓度的变化与sIL-2R(r≥0.6979,P＜0.05),TNF(r≥0.7782,P＜0.05)水平呈显著正相关;而重症乙肝、肝炎后肝硬化患者HBV DNA与sIL-2R(r≤0.2963,P＞0.05),TNF(r≤0.3987,P＞0.05)无相关性.结论急、慢性乙肝患者细胞因子sIL-2R、TNF与体内HBV复制程度密切相关,提示抗病毒在急、慢性乙肝治疗中是一个积极有效的措施.
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竞争性聚合酶链反应定量检测HBV DNA及对干扰素治疗的初步评价
目的:研究HBV DNA浓度与临床疾病关系及对干扰素治疗效果进行评价.方法:应用竞争性聚合酶链反应技术检测42例慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者血清HBV DNA含量,并对26例患者进行了人白细胞干扰素治疗前后循环血中HBV DNA浓度的动态观察.结果:慢乙肝患者血清HBV DNA含量在5×100～5×108拷贝/μl之间;血清HBV DNA含量与ALT活性相关关系不明显(r＝0.2862,P＞0.05);干扰素治疗前完全反应组HBV DNA浓度显著低于部分反应组(t＝4.84,P＜0.01)和无反应组(t＝6.26,P＜0.01).结论:HBV感染后产生的各种临床疾病类型可能主要归于宿主免疫应答的不同,HBV DNA浓度较低的患者(小于10000拷贝/μl)干扰素治疗效果较好,定量检测HBV DNA浓度在抗病毒药物疗效预测和评价中是一个有重要意义的参考指标.
关键词： 定量聚合酶链反应 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸 干扰素 -
雌激素受体相关受体α与雌激素受体在子宫内膜癌组织中的表达
目的 雌激素受体(estrogen receptor,ER)α、β在子宫内膜癌的发生发展中起着非常重要的作用.有研究提示,雌激素受体相关受体α(estrogen receptor-related receptor α,ERRα)与ER竞争配体也参与子宫内膜癌的发生,但详细的机制尚不明了.文中研究的目的 是检测ERRα和ERα、ERβ在子宫内膜癌中mRNA的表达水平,并探讨其关系. 方法 采用real-time TaqMan PCR定量的方法,检测37例子宫内膜癌组织(内膜癌组)、25例癌旁组织(癌旁组)以及20例正常子宫内膜(对照组)中ERRα和ER亚型mRNA的表达量. 结果 3组患者中所有受体均有表达,在内膜癌组中,ERα和ERβ表达水平较对照组明显下降(P<0.05),ERRα的表达水平明显升高(P<0.05).癌旁组患者的所有指标与癌组织和正常内膜组织相比均显著升高(P<0.05). 结论 子宫内膜癌组织中ERα、ERβ低表达,而ERRα相对高表达,癌旁组织中3种受体均为高表达,说明癌组织中部分ERα、ERβ失活,ERRα在内膜细胞向癌细胞进展过程中起着非常重要的调节作用.
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定量聚合酶链反应检测乙肝患者HBV DNA的临床意义
HBV DNA是目前检测乙肝病毒敏感、直接的指标.定量聚合酶链反应(PCR)[1]检测HBV DNA更趋敏感稳定.我们应用此技术检测各种肝炎患者血清HBV DNA含量,以探讨其含量与疾病严重程度的相互关系.
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慢性乙肝患者HBVDNA与其他实验指标的关系
为了探讨慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)血清水平及临床与病理的关系,应用定量聚合酶链反应(PCR)法对HBVDNA进行了定量检测,且对其与病理分级、肝功能和HBV标志物(HBVM)的相互关系进行了探讨.
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肺癌组织DcR3基因表达与临床TNM分期的关系
目的 研究DcR3基因在原发性肺癌组织中扩增和表达情况,探讨该基因在原发性肺癌中过度表达的临床意义.方法 利用免疫组织化学法检测26例肺癌组织和21例肺部良性病变组织DcR3蛋白的原位表达;荧光定量PCR法检测26例肺癌组织中DcR3基因的扩增倍数.结果 免疫组织化学显示肺癌组织存在DcR3表达,并且呈现肿瘤特异性.部分肺癌组织出现细胞浆和细胞核DcR3表达,以细胞核内表达为主.仅4.8%的肺部良性病变组织存在DcR3表达.38.5%的肺癌组织中DcR3基因扩增倍数超过2,平均扩增倍数为1.87±1.25.结论 DcR3在肺癌组织中存在细胞浆表达和细胞浆胞核均表达,以细胞核内为主的两种现象.原发性肺癌患者存在DcR3基因的扩增和过度表达,DcR3表达水平随着肺癌TNM临床分期的增加而增高.
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荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎患者血清HBV DNA及临床价值
目的 探讨荧光定量聚合酶链反应法定量检测乙型肝炎病毒(HBV)核酸的临床应用价值.方法 应用荧光定量聚合酶链反应定量检测1962例乙型肝炎患者血清HBV DNA水平并与血清HBV标志物进行比较,并对35例乙型肝炎患者在拉米夫定治疗前后血清HBV DNA含量及相关指标作动态观察.结果 乙型肝炎患者HBV DNA定量范围在6.79×102～1.95×109拷贝/毫升之间,在HBeAg阳性患者,其检出率和定量拷贝数较高.拉米夫定治疗后患者外周血HBV DNA载量下降明显.结论 荧光定量PCR法是一种相对准确、灵敏度高、特异性强的定量检测HBV DNA的技术,对乙型肝炎诊断、指导、临床用药和疗效监测方面具有实用价值.
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聚合酶链反应定量检测乙型肝炎病毒DNA的临床意义
乙型肝炎病毒(HBV)感染时,外周血中HBV--DNA是病毒复制直接和可靠的标志.自1995年以来,我们用定量聚合酶链反应(PCR)法检测HBV--DNA含量共170例,现对其临床意义进行分析评价.
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实时荧光定量PCR分析雌激素受体相关受体α,β,γ与雌激素受体α,β在卵巢癌中mRNA的表达模式
目的:明确孤儿受体一雌激素受体相关受体(estrogen receptor-related receptor,ERRs)各亚型以及雌激素受体亚型在卵巢癌中mRNA的表达模式.方法:采用Light-Cycler-PCR定量检测40例卵巢癌标本以及15例正常卵巢组织中各种ERRs亚型和Ers亚型mRNA的表达丰度.采用ELISA方法分析各样本血清CA-125水平.结果:卵巢癌组织中ERRα mRNA表达的丰度和阳性表达率显著高于正常卵巢组织(P=0.04和P=0.02),ERRβ在卵巢癌组织和正常卵巢组织中的RNA表达的丰度和阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05);ERRγ mRNA在正常卵巢以及卵巢癌组织中表达的丰度差异无统计学意义(P＞0.05),但卵巢癌组织中ERRγ的阳性表达率显著增高(P=0.045).ERRs家族和Ers家族在卵巢癌中有很高的共同表达率,Erα/ERRα的比率在卵巢癌组织中明显下降(P=0.0412).结论:ERRs与Ers在卵巢癌中有共同表达,两个家族间的相互作用可能是卵巢癌复杂的肿瘤内分泌生物学行为的分子基础.
