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荧光定量RT-PCR在快速检测流感病毒A型和B型上的应用研究
[目的]探讨荧光定量RT-PCR在流感病毒快速检测上的意义.[方法]收集疑似流感样本20例,分别用定量RT-PCR技术和鸡胚分离培养方法进行检测.[结果]26份标本中定量RT-PCR检测阳性率为57.7%(15/26),鸡胚分离培养检测的阳性率为26.9%(7/26).两者的阳性率有统计学差异.[结论]荧光定量RT-PCR方法在检测流感病毒方面具有快速、操作方便、特异性强、灵敏度高优点.因此可以作为一种快速流感病毒检测的诊断方法.
关键词： 荧光定量RT-PCR 鸡胚培养 流感 -
荧光定量RT-PCR快速检测B型流感病毒的研究
目的:利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测B型流感病毒的方法.方法:根据B型流感病毒HA基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与普通RT-PCR法进行比较.结果:B型流感病毒检测反应的灵敏度为5.0×10-6 ID50,标准曲线相关系数为0.998,扩增效率为107.8%,5种非B型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法具有很好的稳定性、重现性和特异性.结论:本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测.
关键词： B型流感病毒 荧光定量RT-PCR 快速检测 -
雷公藤甲素对血管生成的抑制作用
利用体外培养人脐静脉内皮细胞,经不同浓度的雷公藤甲素(0、5、10、20、30 μg/L)处理后,MTT法显示雷公藤甲素可抑制内皮细胞的增殖,5 μg/L雷公藤甲素的抑制率达29.15%;琼脂凝胶立体细胞培养系统检测发现内皮细胞经雷公藤甲素作用后,其游走能力降低;鸡胚尿囊膜试验观察到雷公藤甲素可有效抑制血管的生成;荧光定量RT-PCR检测发现雷公藤甲素可下调内皮细胞u-PA mRNA的表达.因此认为,雷公藤甲素可能在基因水平上干扰内皮细胞u-PA mRNA的表达,减少u-PA蛋白的生成,从而有效地抑制血管内皮细胞的增殖和移行,这可能是雷公藤甲素抑制血管生成的主要机制之一.
关键词： 雷公藤甲素 内皮细胞 尿激酶型纤溶酶原激活物 血管生成 荧光定量RT-PCR -
荧光定量RT-PCR检测早期宫颈鳞癌组织中MMP-7和CK20的表达
目的:检测宫颈癌组织中基质金属蛋白酶7(MMP-7)mRNA和细胞角蛋白(CK20)mRNA的表达水平,并探讨其临床意义.方法:采用实时荧光定量RT-PCR检测33例宫颈鳞癌和12例正常宫颈组织中MMP-7 mRNA和CK20 mRNA的表达水平.结果:MMP-7 mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达水平高于正常宫颈组织(P=0.018),与宫颈鳞癌病理分级、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与临床分期、年龄因素无关(P均0.05);CK20 mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达水平高于正常宫颈组织(P=0.002),与宫颈鳞癌分期、病理分级、淋巴结转移有关(P均<0.05),而与年龄无关(P0.05);MMP-7 mRNA与CK20 mRNA之间存在正相关(r=0.427,P=0.026).结论:MMP-7 mRNA及CK20 mRNA的高表达与宫颈鳞癌的侵袭转移有关.
关键词： 宫颈鳞癌 基质金属蛋白酶7 细胞角蛋白CK20 荧光定量RT-PCR -
雷公藤甲素对血管内皮细胞迁移活性的作用
目的观察雷公藤甲素对血管内皮细胞迁移活性及尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)表达的影响,探讨雷公藤甲素抑制血管生成的机制.方法体外培养人脐静脉内皮细胞,传至第三代,接种于琼脂凝胶立体细胞培养系统后,加入不同质量浓度的雷公藤甲素(0,5,10,20,30μg/L),培养48 h,观察内皮细胞的迁移活性;荧光定量RT-PCR检测u-PAmRNA的表达;免疫组织化学染色检测内皮细胞u-PA蛋白表达量.结果雷公藤甲素可明显抑制内皮细胞的迁移活性,使细胞游走距离缩短;可减少内皮细胞u-PAmRNA和蛋白的表达.结论雷公藤甲素可能通过基因水平干扰内皮细胞u-PAmRNA的表达,抑制u-PA蛋白的表达,从而有效地抑制血管内皮细胞迁移,这可能是雷公藤甲素抑制血管生成的主要机制之一.
关键词： 雷公藤甲素 血管内皮细胞 尿激酶型纤溶酶原激活物 迁移 荧光定量RT-PCR -
EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制
目的 研制一种能同时检测EV71,CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要用于EV71,CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测.方法 设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围;同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测.结果 试验得到了阳性重组质粒,线性范围在5* 102 copies/μl～105 copies/μl,该范围内检测结果良好;优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0.48,0.24μmol/L,EV71上下游引物和探针浓度分别为0.40,0.20 μmol/L.敏感度达到500 copies/μl,重复性变异系数CV≤5％;该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强,在-20℃下可以保存一年,对EV71,CA16肠道病毒具有良好的特异度.用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品,阳性检出率为100％ (20/20),阴性检出率为100％(6/6).结论 试验建立的EV71,CA16肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于EV71,CA16肠道病毒的临床诊断.
关键词： 荧光定量RT-PCR EV71 CA16肠道病毒 快速检测 -
肺癌胸腔积液肺耐药相关蛋白(LRP)基因检测及临床意义
目的 探讨胸腔积液肺耐药蛋白基因检测临床意义.方法 用荧光定量RT-PCR法检测114例肺癌患者胸腔积液标本(腺癌80例,鳞癌17例,差分化癌10例,小细胞癌7例)肺耐药蛋白基因表达,并进行胸腔积液细胞学检测.结果 腺癌、鳞癌、差分化癌及小细胞肺癌胸腔积液LRP mRNA阳性率及中位拷贝数分别为72.94%(62/85),45.45%(5/11),40.00%(4/10),28.57%(2/7);23.58,19.22,20.15,8.36 copies/ml.非小细胞肺癌各种病理类型标本中LRP mRNA阳性率均显著高于小细胞肺癌(P均<0.05),在非小细胞肺癌的各种病理类型中,以腺癌LRP mRNA阳性率高;非小细胞肺癌各种病理类型胸腔积液标本LRP mRNA中位拷贝数无显著性差异(P均>0.05).结论 胸腔积液LRP mRNA检出,不仅明确了肺癌的诊断,也表明该肺癌细胞具有耐药性.
关键词： 肺耐药蛋白基因 荧光定量RT-PCR 肺癌 胸膜转移 耐药性 -
三种基因在非小细胞肺癌外周血有核细胞中阳性表达的意义
目的 为确定外周血有核细胞中LUNX基因、CK19基因和S100A4基因是检测非小细胞肺癌外周血微转移的重要指标提供实验依据.方法 术前抽取外周血,通过荧光定量PCR (PCR)检测其肺组织特异性蛋白(LUNX)、细胞角蛋白19(CK19)和钙结合蛋白A4(S100A4)的表达情况,并对其进行半定量分析.结果 肺癌患者外周血标本中LUNX mRNA、CK19 mRNA和S100A4mRNA的阳性表达率分别为66.7％、62.5％和56.3％,明显高于肺良性疾病患者和健康志愿者(P＜0.05),这三种基因的表达与组织学类型、肿瘤位置有关,在腺癌中的阳性表达高于鳞癌,在周围型肺癌中的表达高于中央型肺癌.3种基因的表达与肿瘤的大小无明确关系.随着肿瘤分期的增高和淋巴结转移的发生,三种基因的表达有明显增高的趋势.结论 LUNX mRNA和CK19 mRNA、S100A4mRNA可作为检测肺癌微转移的分子标志物.
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某区首例由诺如病毒引发腹泻的流行病学调查和实验室检验分析
目的 查找一起学校群体性感染性腹泻的原因,为制定防控措施提供科学依据.方法 结合现场流行病学调查,采集肛试子标本4份、食品4份采用荧光定量RT-PCR法初步快速检测诺如病毒、肠道致病菌,采用国标检验方法对实验结果进行进一步确认;水标本3份进行细菌总数检测.结果 1份肛试子标本诺如病毒阳性,未检出肠道致病菌,细菌总数低于检出限.结论 本次腹泻依据实验室检测结果可能由诺如病毒引起.
关键词： 感染性腹泻 诺如病毒 肠道致病菌 荧光定量RT-PCR -
TaqMan荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒的研究
本研究根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,RT-PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体得到阳性质粒,即为质粒标准品.通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法.该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性.
关键词： 猪传染性胃肠炎病毒 TaqMan探针 荧光定量RT-PCR -
实时荧光定量RT-PCR内参基因的选择
实时荧光定量RT-PCR是在PCR反应体系中加入荧光化学基团，并通过实时荧光定量PCR仪，进行实时、自动检测整个PCR扩增过程中的荧光信号，从而对扩增产物进行实时定量分析的方法。它具有高灵敏、高通量、定量准确、可重复、污染少等优点，被广泛应用于基因诊断，病毒筛选，细胞和组织中RNA的定量等。在采用RT-PCR进行研究的过程中，我们通常需要加入内参基因作为参考，内参基因又称为管家基因，它主要是用来平衡样本之间浓度和纯度的差异，减少实验误差，使得实验结果更加准确，所以内参基因的选择尤为重要。
关键词： 实时 荧光定量RT-PCR 内参基因
