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长沙市家禽市场污水来源H9N2亚型禽流感病毒NS基因进化分析
目的 对长沙市家禽市场污水来源的H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨其传播风险.方法 从家禽市场收集1份H9N2 AIV样本(C09055049)进行NS基因PCR扩增和TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸比对和进化树构建.结果 序列分析表明,NS基因核苷酸序列全长890bp,分别编码NS1(217个氨基酸)和NS2(121个氨基酸)两个蛋白,进化树显示本研究中的NS基因属于A等位基因群的A/ Chicken/ Shanghai/F/1998-1ike,起源于国内早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94；NS基因与进化树不同分支代表株氨基酸比对显示,NS1与A/Chicken/Shanghai/F/98同源性高(96.3％),NS2与A/Chicken/ Beijing/1/1994和A/ Chicken/ Shanghai/ F/ 1998同源性高(96.7％).H9N2 AIV的NS1蛋白第92位D氨基酸,且NS1蛋白C-端缺失13个氨基酸,表现为低致病性的分子特征.结论 家禽市场污水来源的H9N2 AIV的NS1蛋白缺乏高致病性及感染人的分子特征,传播至人的风险较小.
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家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒NS基因分析
对长沙市家禽市场污水来源的H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza viruses,AIV)的非结构蛋白(Nonstructural,NS)基因进行进化和分子特征分析,探讨污水中H5N1病毒的传播风险.9份家禽市场环境污水H5N1亚型AIV标本进行NS基因TA克隆测序,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行氨基酸(amine acid,aa)比对和进化树分析.共得到8个阳性克隆,进化树构建显示8个H5N1的NS基因均属于A亚群,其编码的NS1和NS2蛋白与A亚群代表株(A/chicken/ Hubei/w h/ 1999)aa同源性分别为90.1％～92.5％和91.0％～92.6％,8个H5N1的NS1和NS2 aa之间的同源性分别为93.8％～100.0％和98.4％～100.0％.8个H5N1的NS1蛋白均具有缺失80～84位aa、C末端携带有ESEV的PL基序和第92位aa为E的高致病性分子特征.家禽市场污水来源的H5N1亚型AIV的NS基因具有高致病性的分子特征,这种基因特征表明污水可能传播H5N1病毒.
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人禽流感H5N1毒株NS基因特征和进化
目的:通过对人禽流感H5N1毒株NS基因序列的变异分析,揭示毒株NS基因特征与进化.方法:检测广东地区人禽流感H5N1毒株NS基因核苷酸序列,同时检索全球人禽流感H5N1毒株NS基因序列,采用DNAStar5.0软件对检索的人禽流感H5N1毒株NS基因核苷酸序列进行比对和分析;并结合流行病学资料对变异毒株进行进化速度分析.结果:根据对NS1基因和NS2基因核苷酸序列进行同源性比较,发现分成两个系列:1997～1998年人禽流感毒株为一个系列(G1),2003～2006年毒株为另一个系列(G2);其中,2003～2006年毒株NS1基因和NS2基因中,2004～2006年越南、泰国毒株为第1亚组(G2a),2005～2006年印尼毒株为第2亚组(G2b),2006年中国大陆毒株和2003年香港毒株为第3亚组(G2c)、2006年中西亚、北非毒株为第4亚组(G2d).NS1基因74个氨基酸位点置换,占32.2%(74/230);其中,中国大陆2006年2株毒株(ZJ-16-06、GD-01-06)的NS1基因有3个位点有改变:A086T、F201Y和P215L.NS2基因共有31个氨基酸发生置换,置换率为25.6%(31/121);中国大陆2006年2株毒株(ZJ-16-06、GD-01-06)的NS1基因有3个位点有改变,包括E/K036G、S044T和L058F.NS1基因Ks值为10.1×10-6～33.4×10-6Nt/d,Ka值为11.6×10-6～17.6×10Nt/d;显示NS1基因受到机体免疫压力较大,检验发现基因进化存在明显选择性压力存在,而GD-01-06的NS1基因受到选择性压力较小;与NS1基因比较,NS2基因的同义突变和错义突变速度均降低,但尤以错义突变速度降低明显(Ks值为15.5×10-6～25.5×10～Nt/d,Ka值为7.39×10-6～10.1×10-6Nt/d).2003～2006年毒株NS1基因丢失第80～84位氨基酸序列(TLASV),引起氨基酸结构改变;而糖基化位点未改变.结论:目前NS1基因和NS2基因进化分成两组;NS1基因除自发置换进化较快外,受到明显机体免疫机制压力,第80～84位氨基酸TIASV丢失可能对致病性发生影响.2006年中国大陆毒株NS1基因和NS2基因均有3个氨基酸与其它毒株有别,显示中国大陆人禽流感H5N1毒株NS基因正在向另一方向进化.人禽流感H5N1毒株NS基因在自然界变异非常频繁,不断变异将影响H5N1毒株在人-人传播能力和引发大流行.
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福建省禽流感病毒非结构蛋白基因特征分析
目的 明确福建省不同亚型不同源的禽流感病毒非结构蛋白基因(non-structural gene,NS)的遗传进化关系及氨基酸变异特征.方法 将2011年分离的毒株A/Chicken/Fujian/FZ04/2011(H9N2)(FZ-04株)、A/Chicken/Fujian/FZ11/2011(H9N2)(FZ-11株)的NS基因,与GenBank上登录的1997-2011年福建省不同源不同亚型的AIV毒株及国内外代表株的NS基因进行序列比对和遗传进化分析.结果 FZ-04和FZ-11株与福建省AIV的NS基因同源性分别为88.2%～99.0%,88.3～99.4%.福建省H5N1亚型毒株均属于Y439亚群,H9N2亚型毒株均属于Y280亚群.福建仅H5N1毒株的NS1蛋白80-84位有5个氨基酸缺失,且在羧基末端存在ESEV/GSEV两种PL基序,这可能是福建省区分高致病性和低致病性禽流感病毒的标志之一.结论 NS基因的特征分析表明,福建省H9N2毒株没有向高致病性H5N1毒株突变的嗜性,为今后进一步分析福建省禽流感病毒的NS基因遗传进化关系及毒力变异提供科学依据.
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H5N1亚型和H3N2亚型禽流感病毒广西株NS基因的克隆和序列分析
目的 对3株分离自广西的禽流感病毒的NS基因进行序列分析,试图从分子水平分析和了解广西地区禽流感病毒NS基因的变异特点和进化规律.方法 根据GenBank上登录的已知禽流感病毒的NS基因全序列设计引物,对3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株A/DK/GX/1566/04(H3N2)、A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)的cDNA进行PCR扩增NS基因,并将其克隆到pMD-18T载体上,分别获得全长为855bp、834bp、837bp的NS基因全序列.结果 2株H5N1亚型禽流感病毒广西株间NS基因序列的同源性为95.3%,而2株H5N1亚型禽流感病毒株与H3N2亚型禽流感病毒株之间NS基因序列的同源性为94.0%~94.1%.H5N1亚型禽流感病毒广西株的NS基因在第238-253位核苷酸处均发生了15个核苷酸缺失,与我国广东、香港、云南、湖南、湖北及东南亚等不同地区的毒株比较,NS基因的核苷酸同源性为70.2%~97.6%.在NS基因系统进化树中,3株禽流感病毒广西株都属于A亚群,但处在不同的分支上,其中A/DK/GX/1566/04(H3N2)与广东、香港2001-2003年分离株处于同一分支;A/Goose/GX/737/05(H5N1)、A/Goose/GX/2775/05(H5N1)与我国华南地区以及韩国、越南、泰国等亚洲东南部国家的2003年以后的分离株有共同起源.结论 3株2004-2005年分离自广西的禽流感病毒株NS基因之间的同源性均高于94%,都属于A亚群.
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鹅细小病毒分离株HG5/82的分子特征分析
本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段.将该片段分别进行克隆及序列测定,并与GPV国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较.结果表明:HG5/82株非结构蛋白(Non-structure,NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸.HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸.序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征.为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础.结构基因VP3间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性.HG5/82与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性.
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多重RT-PCR同步快速检测A型和B型流感病毒
目的建立特异、敏感、快速、同步检测含漱液中A、B型流感病毒的分子生物学检测方法.方法以流感病毒A型保守的M基因和流感病毒B型的NS基因为模板分别设计的两对引物,用MRT-PCR同时扩增A型M基因和B型NS基因的片断,得到相对应的病毒片段,根据扩增出的片段的位置和大小来判断含漱液中A、B型流感病毒分型.结果用MRT-PCR从19株A型流感病毒毒株和11株B型流感病毒毒株分别特异地扩增出M基因501bp的片段和NS基因136bp的片段,灵敏度可达1.6×10-5TCID50;对2份黑天鹅的咽拭子和肺组织标本均检出A型流感病毒M基因501bp的片段.结论多重逆转录聚合酶链反应能特异、敏感快速的检测A、B型流感病毒.
关键词： 流感病毒A型 M基因 B型 NS基因 多重逆转录聚合酶链反应(MRT-PCR) -
脱氧核酶在培养人气道上皮细胞体系内的抗甲型流感病毒 NS基因效应
目的 探讨针对甲型病毒(influenza A virus,IFV)NS基因特异性的脱氧核酶(DNAzyme,DZ-NS)在培养的人气道上皮细胞(9HTEo)体系内对甲型流感病毒复制的抑制效应,方法 光镜观察DZ-NS对IFV致9HTEo细胞病变效应变化的影响;病毒空斑形成阻断试验及四甲基偶氮唑盐比色试验(MTT)检测脱氧核酶DZ-NS对IFV复制的抑制和对感染IFV的9HTEo细胞的保护作用;RT-PCR检测DZ-NS对IFV mRNA表达的抑制作用.结果 DZ-NS可明显改善IFV所致的细胞病变并能明显提高细胞感染IFV后的存活率(P＜0.01);可显著抑制IFV-NS基因mRNA的表达;空斑实验病毒抑制率可达80.11%;DZ-NS在细胞内对IFA病毒表达的抑制效率,明显高于作为对照的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,AS-NS)(P＜0.05).结论 在9HTEo 感染IFV细胞模型系统,DZ-NS能高效阻断IFV的NS基因的表达,是一种特异性的、高效的抗IFV基因治疗剂.
