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H7N9禽流感病毒HA基因在杆状病毒中的表达及检测
目的 利用昆虫杆状病毒表达系统表达H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因,获得重组HA蛋白,并验证其活性.方法 全基因合成H7N9禽流感病毒全长HA基因,将HA基因进行扩增并克隆到pFastBacI载体中,构建重组杆状病毒表达载体,经PCR鉴定后将其转染昆虫sf9细胞,再采用SDS-PAGE实验和免疫印迹法检测重组HA蛋白的表达.HA蛋白经纯化后,采用血凝试验鉴定其红细胞凝集活性.结果 PCR结果显示重组杆状病毒表达载体的扩增产物大小约为4000 bp,SDS-PAGE电泳显示纯化的表达蛋白分子量为63 KD,免疫印迹检查结果显示表达蛋白可以与特异性HA抗体进行反应,产生条带与理论大小相当.血凝试验结果显示表达的蛋白能使红细胞凝集,滴度为1:64.结论 禽流感H7N9的HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达,并具有血凝活性.
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流感病毒A/PR/8/34重配母本株高免疫原性HA蛋白制备及鉴定
制备流感病毒经典重配过程中所需的A/PR/8/34母本株血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)抗血清.A/PR/8/34流感病毒灭活纯化后经菠萝蛋白酶消化.5％～20％蔗糖连续密度梯度离心法纯化HA蛋白.单向免疫扩散法(Single Radial Immunodiffusion,SRID)筛选目的蛋白.SDS-PAGE法鉴定目的蛋白.纯化的A/PR/8/34 HA蛋白免疫兔子制备抗血清,血凝抑制试验(Hemoglutination Inhibition Assay,HI)测定HA抗血清效价,经SRID法鉴定HA抗血清纯度.成功制备了高免疫原性A/PR/8/34 HA蛋白;兔抗血清HI滴度可达10240,SRID法鉴定为高纯度HA抗血清.制备了流感病毒经典重配中关键试剂,摸索成功整套技术方法,为我国自主研发季节性流感疫苗株奠定了基础.
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流感病毒经典重配中X-157母本株HA抗血清制备
目的 制备流感病毒经典重配过程中所需的X-157母本株血凝素蛋白(Hemagglutinin,HA)抗血清.方法 X-157株流感病毒灭活纯化后经菠萝蛋白酶消化HA蛋白,蔗糖连续密度梯度离心法纯化,SDS-PAGE法鉴定纯化HA蛋白,免疫兔子收集抗血清,血凝抑制试验法(Hemoglutination Inhibition assay,HI)测定抗血清效价,单向免疫扩散法(Single Radial Immunodiffusion,SIRD)鉴定HA抗血清纯度.结果 成功制备了高免疫原性X-157株HA蛋白,兔抗HA血清HI滴度可达2560,SIRD鉴定为高纯度HA抗血清.结论 制备了流感病毒经典重配中关键试剂,摸索成功整套技术方法,为我国自主研发季节性流感疫苗株奠定了基础.
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H7N9病毒诱导宿主HA抗体产生的特异性及交叉反应
目的 揭示人感染H7N9宿主血清HA抗体的产生及与其他HA亚型的交叉反应特性.方法 生物公司合成各亚型HA蛋白胞外域核苷酸序列,并克隆到改造过的pCDNA3.1载体上构建表达质粒.采用哺乳动物细胞表达体系表达C端带标签的H1、H3、H5和H7重组HA蛋白.用抗标签的抗体捕获293T细胞转染上清中的HA蛋白.用建立的ELISA法检测22例H7N9感染者血清抗体与蛋白H1、H3、H5、H7(2013)和H7(2017)的结合反应,同时设H1N1感染组及健康对照组.结果 成功构建H1、H3、H5和H7重组HA蛋白表达质粒,表达蛋白大小约72000～100000 Mr.在检测的22例34份H7N9感染血清,对2013年及2017年分离的H7N9病毒株的HA蛋白均有显著结合[OD值=(1.85±0.27)、(1.54±0.27)],与健康对照组及H1N1组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).同时H7N9血清组与组1的H1、H5有交叉反应,OD值分别为(1.53±0.49)和(0.92±0.53),与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),与组2的H3有交叉反应[OD值=(2.09±0.22)],与健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).而健康对照组与H1、H3有一定的结合反应,与H5、H7几乎不结合.结论 人感染H7N9病毒诱导的宿主血清HA抗体不仅与H7N9结合且与其他亚型HA蛋白有高度交叉反应,为广谱中和抗体的筛选及疫苗的研发提供了依据.
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H5N1病毒HA蛋白对小鼠外周免疫器官的损伤及其机制
目的 研究H5N1病毒HA蛋白作用于小鼠后对其外周免疫器官脾脏的损伤其相关细胞因子的分泌.方法 通过昆虫-杆状病毒表达系统表达H5N1病毒HA蛋白,并经镍亲和磁珠纯化,将重组的HA蛋白作用于小鼠,72 h后,取其脾脏,观察其镜下形态学变化；分离脾细胞并培养,检测其细胞因子的分泌.结果 脾组织病理表现为局部性弥漫性肺泡损伤,单核细胞侵润,脾脏肿胀,毛细血管充血,生发中心局部结构破坏,有空泡样改变,淋巴细胞减少,见较多大单核吞噬细胞.HA蛋白预处理的小鼠其脾细胞分泌IP-10、MCP-1a、Rantes较PBS预处理的小鼠明显增高；同时HA蛋白预处理组小鼠脾细胞在LPS刺激后分泌的IFN-γ、IP-10、MCP-1a、Rantes较PBS处理的小鼠其脾细胞明显增高.结论 气道给予H5N1 HA表面膜蛋白能够始动异常的免疫应答,引起急性肺损伤和外周淋巴器官与免疫细胞破坏.
