首页 > 文献资料
-
酵母三杂交技术的应用策略及在病毒研究中的应用
从酵母双杂交系统衍生出来的酵母三杂交系统是一种主要用于研究细胞内RNA-蛋白质相互作用强大的技术方法,也为病毒相关研究,尤其为研究病毒生活史中病毒RNA与病毒蛋白和宿主细胞蛋白的相互作用提供了新的工具.本文重点介绍了此种形式的酵母三杂交系统的原理、缺陷、应用和应用策略.另外,本文还介绍了同时发展起来的另外两种形式的酵母三杂交系统,即分别用于研究小分子配体-受体相互作用、复杂蛋白质相互作用的酵母三杂交系统.
关键词： 酵母三杂交 RNA-蛋白质相互作用 配体-受体相互作用 蛋白质相互作用 -
中药蛋白质组学研究策略
蛋白质组学在中药研究中的应用已十分广泛,有许多较为成功的实例.作者回顾了前人应用蛋白质组学技术对中药复杂体系的研究工作,并提出建立一门专门针对中药研究的蛋白组学,即中药蛋白质组学.该文对中药蛋白质组学的研究策略及未来的研究方向进行了综述和思考,希望为从事中药蛋白质组学研究者提供一点思路.
-
一种基于多数据源融合的酵母蛋白质相互作用预测方法
蛋白质-蛋白质相互作用在生命活动中起着重要的作用.本文通过整合多个数据源,采用Logistic回归模型,对模式生物酵母所有的蛋白质之间相互作用进行了计算预测,得到了一个酵母蛋白质相互作用的加权网络,结果分析表明本文得到的蛋白质相互作用网络有较高的可靠性.
关键词： 蛋白质相互作用 多数据源 Logistic回归 信号通路 -
PTEN与NHERF-1相互作用
目的 筛选与PTEN结合的含PDZ结构域的蛋白,并利用蛋白质组学方法对筛选出的蛋白质的相互作用予以鉴定.方法 利用PDZ蛋白质芯片筛选PTEN的结合蛋白.对所发现的PTEN与NHERF-1的相互作用,应用GST融合蛋白沉降和免疫共沉淀实验等多种方法予以鉴定.结果 发现了几种新的与PTEN结合的含PDZ结构域的蛋白质.并对PTEN/NHERF-1的相互作用进行了进一步研究,发现PTEN的羧基端可与NHERF-1的第一个PDZ结构域(PDZ1)结合.将PTEN羧基末端的4个氨基酸(I-T-K-V)中任何一个突变为丙氨酸,都明显抑制PTEN与NHERF-1的结合.免疫共沉淀结果显示,在细胞内完整的蛋白质分子PTEN与NHERF-1也可以结合.结论 PTEN与NHERF-1之间存在相互作用,该相互作用是由PTEN的羧基末端与NHERF-1的PDZ1结构域结合而实现的,PTEN羧基末端的4个氨基酸对于维持它们之间的结合有十分重要的作用.
-
通过配体文库研究GIPC2 PDZ配体结合特点及其相互作用蛋白
目的 通过验证性筛选配体文库,获得GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,进而找到GIPC2的相互作用蛋白.方法 1)利用酵母双杂交的方法从已有的PDZ配体库中寻找与GIPC2的PDZ结构域配体结合特性;2)根据GIPC2的亚细胞定位和肿瘤相关功能再结合PDZ结构域结合序列的共同特征在蛋白质数据库中预测GIPC2的天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列依次与GIPC2 PDZ结构域或GIPC2全长进行验证反应,从而得到阳性蛋白.结果 1)GIPC2 PDZ结构域的配体结合特性是C末端后4个氨基酸为-X-S/T-X-V/L/I,是Ⅰ类PDZ配体;2)综合GIPC2的生物学特征和GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,在蛋白质数据库中预测得到47个天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列克隆至酵母双杂交系统进行验证,后得到10个确定的阳性蛋白.结论 获得10个GIPC2相互作用蛋白.
-
通过筛选随机多肽文库研究Veli3 PDZ结构域配体结合特性
目的 研究Veli3 PDZ结构域配体的结合特性.方法 用Veil3 PDZ为诱饵蛋白,用酵母双杂交方法 筛选随机多肽文库.结合生物信息学方法 在各种数据库中检索与Veli3 PDZ识别规律相符合的天然人类蛋白质.然后根据蛋白质的功能和细胞定位等性质选择14个潜在新配体用酵母双杂交验证相互作用.文献检索与Veil3 PDZ配体结合的其他PDZ蛋白.结果 Veil3 PDZ结构域配体C-末端保守的氨基酸序列通式可以表示为:[E/X][S/T]X[V/I/L]-COOH(X表示任意氨基酸).这是Class I PDZ结构域配体的特点.用酵母双杂交实验证实14个生物信息方法 预测的潜在配体中有6个配体与Veil3相互作用.另一个PDZ蛋白PSD-95与已报道的Veil3 PDZ配体和本研究新发现的潜在配体有多个相互作用.结论 新发现的6个Veli3PDZ潜在配体为进一步研究Veil3的生物学功能提供新的线索.另外Veli3与PSD-95可能易于同时竞争结合同一配体,其生物学意义还有待进一步研究.
-
相互作用结构域SH3和WW的蛋白质组学研究
在过去十年的研究中,发现许多蛋白质相互作用是通过相互作用结构域(如SH2,WW,SH3等)与其识别的另一个蛋白质中一段短肽序列的结合完成的,蛋白质相互作用结构域在蛋白质亚细胞定位、信号传导和蛋白复合体的组装等方面发挥重要功能.随着蛋白质组学技术的发展,高通量技术用于结构域结合特性及相互作用网络的研究.本文通过概述SH3和WW结构域的蛋白质组学研究策略的新进展,总结结构域的几种现有研究策略.
-
蛋白质相互作用的文本挖掘研究进展
生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质调控,因此研究蛋白质间的相互作用成为理解生命活动的基础.使用文本挖掘方法研究蛋白质相互作用可以充分利用现有的大量文献揭示出与蛋白质相关的潜在知识,构造蛋白质相互作用网络.着重从相关的语料集和工具、所涉及的技术和方法等方面,对蛋白质相互作用的文本挖掘进行综述,并对研究前景进行展望.
-
利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较
近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因,但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解.而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础.
-
H5N1-NP蛋白的原核表达及与宿主蛋白相互作用的初步研究
目的 原核表达并纯化禽流感病毒A/Anhui/1/2005(H5N1)的NP蛋白,并筛选人支气管上皮BEAS-2B细胞总蛋白中能够与纯化的NP蛋白相互作用的蛋白.方法 一方面,构建了含有NP基因的原核表达质粒pET30a-NP,并在大肠埃希菌中获得了可溶性表达.亲和层析和离子交换层析两步对NP蛋白进行纯化.另一方面,制备了BEAS-2B细胞总蛋白.在此基础上,联合应用Pull-down与LC-MS/MS技术来筛选并确认细胞中与纯化的NP蛋白相互作用的成分.结果 构建的pET30a-NP质粒在IPTG诱导下在原核细胞中实现了可溶表达,经过两步纯化后,得到可溶的NP蛋白纯品.Pull-down与LC-MS/MS技术初步筛选到BEAS-2B细胞中20个可能与NP蛋白相互作用的细胞蛋白.还需要进一步的实验来验证他们和NP蛋白之间的相互作用.结论 获得了高纯度的可溶NP蛋白及筛选到20个可能与其相互作用的BEAS-2B细胞候选蛋白.
-
人gp130结合分子与TLE1分子通过同源的Q结构域相互作用
目的确定人gp130结合分子(GAM)与transducin like enhancer of split 1 (TLE1)分子间是否存在相互作用及相互作用的结构基础,以深入研究这两种分子的功能. 方法扩增编码GAM与TLE1分子不同结构域的cDNA,构建含有这些不同结构域的酵母双杂交载体,通过酵母双杂交系统分析和免疫共沉淀试验,研究这两种分子间的相互作用. 结果 DNA序列测定证实成功构建了含GAM与TLE1分子不同结构域的酵母双杂交载体,酵母双杂交分析表明GAM与TLE1分子通过氨基端的Q结构域相互结合,免疫共沉淀试验证实了这一发现. 结论证实GAM与TLE1分子通过氨基端的Q结构域相互结合.
-
EHEC O157∶H7紧密黏附素及突变体与受体Tir的结合特性研究
目的 表达纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC) O15∶H7的紧密黏附素(intimin)及突变体intiminN916Y,并构建其转位紧密黏附素受体(translocated intimin receptor,Tir)结合片段(intimin binding domain,Tir-IBD),通过BIACore技术检测紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD蛋白质相互作用特性的变化,探索特定氨基酸的突变对其黏附结合功能的影响.方法 设计引物采用PCR法自EHEC O157∶H7基因组扩增Tir-IBD的编码基因tir-ibd,TA克隆后构建原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd,经测序鉴定后转化E.coli BL21( DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测.目的蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex 200进行纯化.同时按包涵体复性后纯化的方案制备紧密黏附素及突变体intiminN916Y,将所得高纯度目的蛋白Tir-IBD适当稀释后耦联BIACore3000配套的NTA芯片,在25℃和37℃条件下分别以紧密黏附素及突变体intiminN916Y作为流动相进行BIACore检测.结果 EHEC O15∶H7基因组扩增出了约270 bp的目的片段；原核表达质粒pET-21a(+)-tir-ibd经酶切及测序鉴定与设计序列一致.转化E.coli BL21( DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约15％；PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约10×103,破菌后电泳证实目的蛋白为可溶表达.Ni-NTA亲和纯化和阴离子交换纯化效果明显,高纯度的Tir-IBD蛋白耦联NTA芯片,在25℃和37℃条件下对紧密黏附素及突变体intiminN916Y与Tir-IBD相互作用的BIACore检测结果显示,intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.结论 EHEC O157∶H7的紧密黏附素、突变体intiminN916Y及Tir-IBD经基因克隆后获得了较好的表达,纯化后获得高纯度的目的蛋白.在此基础上建立了蛋白相互作用的BIACore检测体系,证明intiminN916Y特定氨基酸的突变对其结合能力有明显影响并呈温度依赖性.
-
肝细胞生成素205与细胞色素C的相互作用
目的:应用酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)和GST-Pull down技术鉴定肝细胞生成素205(hepatopoietin 205,HP0205)与细胞色素C(cytochrome c,Cytc)间的相互作用.方法:采用PCR技术扩增HP0205和Cytc编码基因,分别将其构建Y2H质粒pDBLeu和pPC86的重组载体.应用Y2H技术将二者的重组质粒共转染酵母MaV203进行鉴定.同时用GST-Pull down方法对其验证.结果:成功克隆HPO205和Cytc编码基因至Y2H载体和相应表达载体,包括pDBLeu-GRER、pDBLeu-CYCS、pPC86-GRER、pPC86-CYCS.经过Y2H鉴定发现.pDBLeu-GRER+pPC86CYCS共转后能激活Ura和His两个报告基因,而pDBLeu-CYCS+pPC86-GRER共转则不能激活任何一个报告基因.GST-Pull down实验显示.GST-CYCS将HP0205沉淀下来,而GST空蛋白不能沉淀HP0205.证实HP0205与Cytc存在相互作用.结论:HP0205可能通过Cytc参与电子传递或/和细胞凋亡过程.
-
应用酵母双杂交技术筛选转录因子MEOX2的相互作用蛋白
目的研究同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2在心肌细胞内与哪些蛋白质存在相互作用.方法应用酵母双杂交技术对人心脏cDNA文库进行筛选.(1)通过PCR方法扩增编码组氨酸/谷氨酸(H/Q)富含区缺失的MEOX2蛋白质(Meox2△HQ)的DNA片断,并克隆进入pGBKT7载体,从而构建"诱饵"质粒pGBKT7-Meox2△HQ;(2)将"诱饵"质粒pGBKT7-Meox2△HQ转化酵母菌AH109,然后从被转化的酵母菌中提取蛋白质,应用抗C-Myc单克隆抗体进行免疫印迹分析,检测"诱饵"蛋白的表达;(3)将被"诱饵"质粒转化的AH109分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/X-α-GAL平板上,以观察"诱饵"蛋白自我激活报告基因与否;(4)将已被"诱饵"质粒转化的AH109与人心脏cDNA文库进行杂交,筛选阳性克隆,分离阳性克隆中的cDNA,并测序.结果Meox2△HQ与pGBKT7中的Gal4 DNA结合域及C-myc在同一读框,并稳定表达融合蛋白"Gal4 DNA结合域-C-myc-Meox2△HQ","诱饵"蛋白不会自我激活报告基因,筛选得到¨个准阳性克隆.结论同源盒基因Meox2所编码的转录因子MEOX2可能与心肌细胞中的多种蛋白质存在相互作用,并参与这些蛋白质表达的调控.
-
蛋白质间相互作用检测方法的研究进展
蛋白质是生命活动的基本功能单元,一切生理反应变化都离不开蛋白质以及蛋白质间的相互作用,人们不仅需要了解单个蛋白的结构及功能,更需要了解蛋白质组内部作用的功能过程,因此,了解蛋白-蛋白甚至蛋白-核酸相互作用的检测方法对于我们开展相关研究甚为重要.蛋白质相互作用分为3个方面:一是多亚基蛋白质的形成;二是多成分的蛋白复合体,如核孔复合体等;三是瞬时蛋白质相互作用.本文拟就蛋白质间相互作用检测方法的研究进展作一综述.
-
乙酰肝素酶调控滋养细胞中细胞因子表达及其对滋养细胞作用的潜在分子机制预测
目的 探究过表达滋养细胞中乙酰肝素酶(HPSE)对细胞因子表达的影响,并且初步预测HPSE对滋养细胞作用的潜在分子机制.方法 选择早孕期人绒毛膜滋养细胞株HTR8/SVneo为研究对象,并构建HPSE过表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入检验组,以及HPSE正常表达稳定转染HTR8/SVneo滋养细胞株,纳入对照组.采用细胞因子抗体芯片半定量检测,对检验组和对照组滋养细胞株中343种细胞因子的变化情况进行检测.应用Image J软件分析和找出差异细胞因子蛋白.采用Western blotting检测2组滋养细胞株中表达水平差异大的细胞因子AXL受体酪氨酸激酶表达水平,以验证细胞因子抗体芯片半定量检测结果 .通过STRING蛋白数据库构建蛋白相互作用关系网络,并应用The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)在线生物信息学分析软件,进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析.结果 ①细胞因子抗体芯片半定量检测结果显示,与对照组滋养细胞株相比,检验组滋养细胞株过表达HPSE后,其细胞因子表达下降,并且检验组与对照组滋养细胞株中细胞因子蛋白表达水平比值<0.6667的细胞因子,即差异细胞因子共计15种,分别为AXL、细胞间黏附分子(ICAM)1、TEK受体酪氨酸激酶、尿激酶型纤溶酶原激活物受体(PLAUR)、金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)2、基质金属蛋白酶(MMP)9、淋巴细胞激活基因(LAG)3、肿瘤坏死因子受体超家族成员(TNFRSF)1B、TNFRSF1A、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、TIMP4、人血小板反应蛋白(THBS)1、白细胞介素17受体B(IL17RB)、连接黏附分子样蛋白(AMICA)及C-C类趋化因子16(CCL16).②Western blotting检测结果显示,检验组滋养细胞株中AXL蛋白表达水平明显低于对照组滋养细胞株,并且差异有统计学意义(t=—6.931,P=0.020),这与细胞因子抗体芯片半定量检测结果一致.③通过STRING蛋白数据库分析结果发现,HPSE可通过血管内皮生长因子(VEGF)A,肿瘤蛋白p53(TP53)和CD44与MMP9产生关联,而MMP9又可直接或者间接与除LAG3、CCL16和IL17RB之外的其他12种差异细胞因子相关联,从而建立相互作用关系网络图.④细胞因子GO功能富集分析结果发现,差异细胞因子主要涉及细胞凋亡负调控和细胞外基质(ECM)分解等41个生物学过程.KEGG信号通路分析结果显示,差异细胞因子主要涉及癌症蛋白多糖信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等6条信号通路.结论 过表达HPSE可调控滋养细胞中细胞因子的表达,可能通过MMP9参与的癌症蛋白多糖信号通路影响滋养细胞的生物学功能.本研究结果可为后续研究HPSE对滋养细胞相关疾病影响,提供研究方向和研究基础.
-
儿童感染的蛋白质组学研究
1概述Wilkins和Williams在1994年首先定义了蛋白质组一词,蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质~[1].而蛋白质组学是近年来出现的一种研究特定细胞、组织或完整生物体所表达的全部蛋白质及其活动规律的新兴学科,其本质是研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白质与蛋白质相互作用等,其目的是从蛋白质水平上全面认识疾病发生、细胞代谢等过程.
-
网络药理学与分子对接技术指导下土大黄苷对慢性粒细胞白血病作用机制研究
目的 近年来,蛋白质相互作用网络及分子对接技术成为中药现代化研究领域十分活跃的一部分,逐渐成为链接中药应用与现代化的重要纽带.本研究基于分子对接技术与网络药理学分析,探讨中药大黄活性成分土大黄苷与慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)相关基因之间的相互作用,寻求土大黄苷作用与CML的可能机制.方法 前期研究中构建了CML蛋白质相互作用网络,并筛选了CML关键靶点蛋白,作为本研究的受体;通过软件Chemoffice 8.0构建土大黄苷的分子结构,导入SYBYL软件中,进行一系列数据处理,作为本研究的配体.利用SYBYL8.1软件的Surflex-Dock模块进行分子对接,用配体-受体亲和力的一致性评分函数进行打分,并对氢键及其结合部位进行观察、分析.进一步对分子对接结果进行文献验证.结果 得到土大黄苷与CML19个相关基因之间的分子对接评分及氢键数,其中与JUN(2G01)受体对接得分及氢键数是高的,说明土大黄苷与JUN(2G01)结合好,可以推断JUN(2G01)是土大黄苷优先选择的作用受体.其次,得分较高的还有SRC (SRC)、JAK2 (5AEP)、MAPK14(2YIX)、FRAP1(3OAW)、MAPK8(3PZE)和PARP1(1U5Y)等.结论 大黄活性成分土大黄苷对CML的作用机制是多靶点、多途径相互作用的,其作用受体可能与JUN、SRC、JAK2、MAPK14、FRAP1、MAPK8和PARP1等基因相关.
-
钙结合蛋白S100A6对Wnt/β-catenin信号途径的影响
目的 研究钙结合蛋白S100A6对Wnt/β-catenin信号途径的影响及其机制.方法 异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达、谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化融合蛋白GST-hS100A6;Western blot和荧光素酶活性分析法检测S100A6对细胞内β-catenin水平和β-catenin/T细胞因子4(TCF4)活性的影响;GST-pulldown和Western blot技术研究S100A6与该信号途径主要成员β-catenin、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、Dvl和Axin之间的相互作用.结果 S100A6可致MG63和HCT116细胞β-catenin水平升高,并可使HEK293细胞β-catenin/TCF4活性增强;S100A6与β-catenin、GSK-3β和Dvl之间存在着直接的相互作用,而与Axin之间无相互作用.结论 S100A6能够增强Wnt/β-catenin信号途径的活性,其机制可能涉及S100A6与该途径重要成员β-catenin、GSK-3β和Dvl之间存在着直接的相互作用有关.
-
应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因
目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因.方法 通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达.随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆.提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Tm/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆.挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析.结果 筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列.结论 筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础.
