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区域性多药耐药铜绿假单胞菌可移动遗传元件研究
目的 探讨多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)中接合性质粒、转座子、整合子、插入序列等可移动遗传元件的存在情况.方法 从临床标本中分离并筛选出49株MDR-PA,用PCR分析接合性质粒遗传标记基因(traA,trbC,traF)、转座子遗传标记基因(tnpA,tnpU,tnsA,merA,tnp513)、插入序列遗传标记基因(ISEcp1,IS26,ISabaI,IS903,ISpa,ISKpn6,ISKpn7,IS1133,ISCR,ISCR3/14)、整合子遗传标记基因(IntI1,IntI2,IntI3)共21种可移动遗传元件.结果 49株MDR-PA共检出11种可移动遗传元件相关基因,阳性率高的为IS26(77.6％);阳性基因构成模式IS26+ ISaba1+ ISCR3/14+ IntI1检出率高,共7株(14.3％);首次在铜绿假单胞菌中检出接合性质粒遗传标记traF;49株MDR-PA中只有2株未检测到可移动遗传元件.结论 接合性质粒、插入序列、转座子、整合子4类可移动遗传元件在本组MDR-PA中均有检出,这些可移动性遗传元件介导多种耐药基因使菌株表现为多重耐药.
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克雷伯属菌耐药元件检测及指标与样本聚类分析
目的 探讨耐药克雷伯属菌获得性耐药相关基因和可移动遗传元件的关系以及与菌株间的亲缘关系.方法 收集20株从患者标本中分离的耐药克雷伯属菌,用PCR法分析67种水平转移获得的β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类获得性耐药基因和12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动元件标志基因,再对检测结果作指标聚类分析(UPGMA法)和样本聚类分析(neighbour-joining法).结果 20株耐药克雷伯属菌共检出6种β-内酰胺类、5种氨基糖苷类、4种喹诺酮类耐药基因和8种可移动遗传元件的遗传标志；指标聚类分析提示,KPC与ISKpn6高度相关联,SHV与IS26高度相关联；样本聚类分析显示,4号与18号株、15号与20号株分别为克隆传播.结论 克雷伯属菌耐药元件检测可揭示菌株耐药的遗传学背景.
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携带blaADC基因鲍曼不动杆菌可移动遗传元件研究
目的 了解携带blaADC基因的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii Ab)中整合子、转座子、插入序列及接合性质粒等可移动遗传元件的携带情况.方法 收集临床分离的179株Ab,用PCR扩增检测blaADC基因,对blaADC扩增阳性的菌株用PCR检测4类可移动遗传元件整合子遗传标记(intl1、intl2、intl3、qacE△1-sull)、转座子遗传标记(merA、tnpU、tnp513、tnpA)、插入序列遗传标记(ISAbal、IS26)及接合性质粒遗传标记(traA、trbC)等基因,并用K-B纸片扩散法对blaADC扩增阳性菌株分别进行药物敏感性试验.结果 179株Ab中共检出blaADC基因阳性117株.其中,intI 1、qacE△1-sull、merA、tnpU、tnp513、ISAbal、IS26检出阳性率分别为71.8％、98.3％、94.9％、93.2％、76.9％、98.3％、100.0％,其余5种可移动遗传元件未检出.每株少检出可移动遗传元件3种,占总株数的0.9％;多检出7种,占总株数的50.4％.结论 携带blaADC基因的Ab易检出各类可移动遗传元件,其耐药性可能与可移动元件的存在有关.
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泛耐药鲍氏不动杆菌获得性耐药相关基因与可移动遗传元件检测指标的聚类分析
目的:调查泛耐药鲍氏不动杆菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii,PDR-ABA)中获得性耐药相关基因和可移动遗传元件遗传标记的存在状况,以及两者的相关性.方法:收集2010年3月到2010年5月临床标本中分离的PDR-ABA菌20株,采用聚合酶链反应(PCR)的方法检测37种β-内酰胺类获得性耐药基因、15种氨基糖苷类获得性耐药基因、5种喹诺酮类获得性耐药基因和8种可移动遗传元件,并用指标聚类分析(SPSS法)分析获得性耐药相关基因和可移动遗传元件遗传标记的相关性.结果:20株PDR-ABA菌共检出5种β-酰胺类获得性耐药基因、4种氨基糖苷类获得性耐药基因、1种喹诺酮类获得性耐药基因、5种可移动遗传元件.指标聚类分析显示获得性耐药基因与多种可移动遗传元件相关联:TEM-1、ADC-like、OXA-23、aac(6’)-Ⅰb、ant(2”)-Ⅰ、ant(3")-Ⅰ、aphA1、adeB与tnpU、ISCR1、IS26、ISaba1高度关联,DHA-1、CARB与IS903关联.结论:本组PDR-ABA携带获得性耐药相关基因导致对相关药物耐药,且获得性耐药相关基因和可移动遗传元件密切相关.
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重症医学科患者主动筛查分离的耐药鲍曼不动杆菌获得性耐药基因及遗传标记检测
目的 了解宁波地区6家三级医院成人ICU患者主动筛查分离的耐药鲍曼不动杆菌中获得性耐药基因与可移动遗传元件的存在状况.方法 采用主动筛查ICU患者收集菌株,聚合酶链反应(PCR)及序列分析检测获得性耐药基因与可移动遗传元件,GN-16药敏卡及K-B法测定药物的敏感性.结果 40株不动杆菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率27.5％,替加环素耐药率25.0％,其他常见抗菌药物耐药率均为100％.检出β-内酰胺酶TEM、ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-24、OXA-66等6种基因,ADC、OXA-2群、OXA-23、OXA-66检出率均达100.0％.检出氨基糖苷类修饰酶基因aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰb、ant(3")-Ⅰ、aph(3')-Ⅰ和armA 16SrRNA甲基化酶基因,阳性率均低于25.0％.可移动遗传元件遗传标记中IS26、ISaba1检出率均达100.0％.intⅠ 1、tnpU检出率均为25.0％.连锁检测ISaba1-ADC、ISaba1-OXA-23阳性率均为100.0％,而ISaba1-OXA-66均呈阴性.获得性耐药基因OXA-2群、OXA-23、OXA-66及ADC与MGEs遗传标记IS26、ISaba1高度相关.结论 6家三级医院筛查分离不动杆菌耐药严重,获得性耐药基因与可移动遗传元件遗传标记存在高度相关.
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耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌oprD基因突变分析及耐药元件研究
目的 调查一组耐碳青霉烯类药物鲍氏不动杆菌可能存在的耐药基因状况,以及与菌株间的亲缘关系.方法 收集分离自痰标本的20株鲍曼不动杆菌,检测膜孔蛋白oprD基因和32种B-内酰胺酶基因,共33种B-内酰胺类药物耐药基因,16种氨基糖苷类药物耐药基因和10种可移动遗传元件.再用DNA测序法分析oprD基因突变,测得DNA序列转为氨基酸序列后与鲍氏不动杆菌敏感株(SDF株)比对,作三维结构同源建模(模板为PDB:3SY7)分析.后对检测结果作样本聚类分析(UPGMA法).结果 20株鲍曼不动杆菌对12种抗菌药物的耐药率均为100.0％.20株菌oprD测得序列完全一致,且突变率达100.0％.oprD基因转为氨基酸序列后蛋白质分子三维结构明显有别于SDF株,同源建模分析提示4个氨基酸残基序列不同可致结构不同.此外还检出4种β-内酰胺酶基因(blaTEM、blaADC、blaOXA-23群、blaO XA-66),6种氨基糖苷类药物耐药基因(aac2'-Ⅰb、aac(3)-Ⅰ、aac (6')-Ⅰb、ant(3”)-Ⅰ、aph3'-Ⅰ、armA)和5种可移动遗传元件(int Ⅰ 1、tnpU、tnp513、ⅠSaba1、ⅠS26),且检出率非常高.样本聚类分析显示20株菌有明显的聚集性,且有3个克隆播散:2-4-5-6-8-9-10-11-12-14-16-17等12株为第1个克隆,1-18-20等3株为第2个克隆,3-6为第3个克隆.结论 膜孔蛋白oprD突变及多种β-内酰胺类药物耐药基因、氨基糖苷类药物耐药基因和可移动遗传元件共同导致本组鲍氏不动杆菌对12种抗菌药物100.0％耐药率,鲍氏不动杆菌菌株聚集现象明显,3个克隆传播提示有医院感染的存在.
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多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组耐药基因检测
目的 检测1株多耐药大肠埃希菌NB8株的遗传学背景.方法 病原分离自2012年4月宁波市第一医院住院患者尿液,作16S rDNA和gyrA基因测序、BLASTn比对确认为大肠埃希菌,采用Illumina HiSeq与Ion Torrent PGM两种大规模并行测序仪进行全基因组分析,再行人工测序.后NB8株和9株已完成全基因组测序的大肠埃希菌耐药基因的比较基因组学研究.结果 多耐药大肠埃希菌NB8株全基因组测序得到一条推定的染色体序列,长4 550 369 bp(内含14个缺口),得到一条推定的质粒序列,长635 377 bp(内含33个缺口).从NB8株全基因组数据中挖掘出了β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、四环素类、多粘菌素的耐药基因,并挖掘出接合性质粒、转座子、插入序列、整合子的遗传标记,以及5大类外排泵基因.结论 多耐药大肠埃希菌NB8株遗传学背景明确,主动外排机制增强也会导致或者增强NB8株的耐药性.质粒、转座子和整合子等可移动遗传元件可以使细菌的耐药性得以快速传播,使受体菌表现为多重耐药.
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气单胞属菌粪便分离株分子鉴定与耐药元件检测
目的：调查一组14株气单胞属菌的菌种分子鉴定情况，以及β‐内酰胺酶类、氨基糖苷类耐药的遗传学背景。方法14株气单胞属菌均分离自2012年1月至12月宁波市第一医院肠道门诊腹泻患者的粪便标本，再作通用引物16SrDNA测序比对判定菌种，然后用聚合酶链反应（PCR）的方法分析23种β‐内酰胺酶基因、6种氨基糖苷类修饰酶基因和6种16SrRNA甲基化酶基因以及6种可移动遗传元件分子标记。结果本组14株菌经16SrDNA测序比对，10株为嗜水气单胞菌，水簇箱气单胞菌、温和气单胞菌、肠棕气单胞菌、斑点气单胞菌各1株。14株气单胞菌共检出5种β‐内酰胺酶基因、4种氨基糖苷类修饰酶基因和3种可移动遗传元件遗传标记基因。其中4号株（嗜水气单胞菌）A Q U基因是新的基因亚型，命名为AQU‐2，11号株（水簇箱气单胞菌）AQU基因也是新的基因亚型，命名为AQU‐3。结论气单胞菌属的菌种鉴定应该以分子鉴定法为准。本组14株气单胞属菌耐药严重，已呈多重耐药。
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鲍曼不动杆菌临床株中可移动遗传元件ISCR1的作用
目的 了解鲍曼不动杆菌临床株中新型可移动遗传元件ISCR1的携带情况及其下游基因环境,探讨鲍曼不动杆菌耐药播散机理.方法 收集多重耐药鲍曼不动杆菌临床株34株和敏感株21株,PCR扩增ISCR1基因及其下游的基因环境,扩增产物测序分析.结果 34株多重耐药鲍曼不动杆菌临床株中,携带ISCR1基因14株,其中11株ISCR1阳性多重耐药株,在ISCR1基因下游携带氨基糖甙类耐药基因armA基因；21株敏感株中,ISCR1基因扩增结果均为阴性.结论 ISCR1元件可能参与了armA耐药基因的水平播散.
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多耐药肺炎克雷伯菌抗菌制剂外排泵基因与可移动遗传元件研究
目的:调查2种抗菌制剂外排泵基因(mdfA、qacE△1)和7种可移动遗传元件(traA、trbC、IS1133、ISEcp1、tnpU、tnp513、qacE△1)在多耐药肺炎克雷伯菌中的存在和变异情况.方法:收集绍兴市人民医院2007年10月-2009年6月住院患者标本中分离的多耐药肺炎克雷伯菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析上述8种基因.结果:加株多耐药肺炎克雷伯菌共检出7种基因,mdfA、traA、trbC、ISEcp1、tnpU、tap513、qacE△1基因的阳性株数分别为18株(90.0%)、2株(10.0)、16株(80.0%)、14株(70.0%)、8株(40.0%)、11株(55.0%)、18株(90.0%),只有IS1133基因未能检出.且这7种阳性基因以7种阳性模式存在,其中(mdfA+trbC+ISEcp1+qacE△1)模式的检出率高.共6株(30.0%).结论:抗菌制剂外排泵基因和可移动遗传元件阳性率很高,这是导致本组菌株呈多耐药的一个重要原因.
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多重耐药志贺菌β-内酰胺类耐药相关基因检测及分析
目的 了解多重耐药志贺菌β-内酰胺类耐药相关基因检测情况,为治疗提供依据.方法 收集嘉兴地区2006年11月-2012年10月间多重耐药志贺菌,以聚合酶链反应(PCR)法检测β-内酰胺类基因、接合性质粒、整合子、转座酶、插入序列和复方新诺明类基因共14种;β-内酰胺类基因和可移动元件遗传元件存在状况的相关性用指标聚类分析(SPSS法).结果 58株多重耐药志贺菌检出β-内酰胺类基因3种(CTX-M-1、TEM、OXA),可移动遗传元件标记基因检出5种(traA、trbC、intI1、ISEcp1、IS903).结论 本组志贺菌β-内酰胺类抗菌素耐药与携带β-内酰胺类耐药基因相关.可移动遗传元件是致本组志贺菌多重耐药的主要原因.指标聚类分析提示可移动遗传元件和获得性耐药相关基因的携带及转移密切相关.
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河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因与可移动遗传元件的分布
目的:观察河南某工厂附近农田土壤中抗生素抗性基因和可移动遗传元件的分布.方法:分别于不同时间点采集河南某工厂主导风向下风向上距离为700～2 500 m不等的7块农田土壤的土样,提取总DNA,采用PCR法检测15种抗生素抗性基因(包括四环素类药物抗性基因tetA、tetC、tetE、tetM、tetQ、tetW,磺胺类药物抗性基因sul Ⅰ、sulⅡ,β内酰胺类药物抗性基因bla-TEM、SHV、CTX-M-1,喹诺酮类药物的抗性基因qnrA、qnrB、qnrS,链霉素类药物抗性基因strA)和4种可移动遗传元件(包括整合酶基因intI1、intI2,插入序列共同区基因orf513、ISCR2),PCR阳性产物送测序,通过BLAST与GenBank数据库进行同源性比对.结果:共检出8种抗生素抗性基因,分别是sulⅡ、tetC、bla-TEM、sul Ⅰ 、tetA、strA、tetM和tetW;3种可移动遗传元件intI1、intI2、ISCR2.各PCR扩增阳性产物经测序比对后,与GenBank已有序列识别度为95％～ 100％.各基因在不同距离土样中的阳性率比较差异均无统计学意义(P＞0.05),sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1在不同时间点的土样中阳性率比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:该工厂附近农田土壤中常见抗生素抗性基因及可移动基因元件为sulⅡ、tetC、bla-TEM、sul Ⅰ和intI1,除sul Ⅰ外,sulⅡ、tetC、bla-TEM和intI1的分布均具有时间差异,但在不同距离农田土壤中分布稳定.
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产OXA-23鲍曼不动杆菌可移动遗传元件研究
目的 了解产OXA-23鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)中整合子、转座子、插入序列及接合性质粒等可移动遗传元件分布状况及其与耐药性的关系.方法 收集中南大学湘雅医院2009年1～6月产OXA-23鲍曼不动杆菌71株;根据CLSI2009年标准采用纸片扩散法进行药物敏感性试验;聚合酶链式反应(PCR)检测3种整合子遗传标记(intI 1、intI 2和intI 3)、4种转座子遗传标记(merA、mpU、tnp513和tnpA)、2种插入序列遗传标记(ISAba1、IS26)及2种接合性质粒遗传标记(traA、trbC),共11种可移动遗传元件;结合药敏结果分析可移动遗传元件与耐药性的关系.结果 intI 1、merA、tnpU、tnp513、ISAba1和IS26检出阳性率分别为:85.9％、7.0％、91.5％、83.1％、100.0％和100.0％.其余5种可移动遗传元件未检出;71株鲍曼不动杆菌每株至少检出2种可移动遗传元件,多检出6种可移动遗传元件,其中大部分受试菌检出5种可移动遗传元件;在国内首次从鲍曼不动杆菌中检出merA基因,且首次在国内同时从1株鲍曼不动杆菌中检出intI1、merA、tnpU、tnp513、ISAba1和IS26共6种可移动遗传元件;对n＜5和n≥5两组耐10种及以上药物菌株比例差异进行x2检验发现,差异具有显著性(P＜0.05),提示可移动遗传元件检出数越高,耐多药菌株数越多,耐药率越高.结论 产OXA-23鲍曼不动杆菌易检出各类可移动遗传元件,与医院鲍曼不动杆菌耐药机制相关的可移动遗传元件主要有intI 1、merA、tnpU、tnp513、ISAba1和IS26.
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一组泛耐药铜绿假单胞菌耐药相关基因的样本聚类分析
目的:调查一组泛耐药铜绿假单胞菌菌株间的亲缘关系.方法:收集2010年1-12月绍兴第二医院住院患者痰液标本中分离到的泛耐药铜绿假单胞菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)方法分析31种β-内酰胺酶基因以及膜孔蛋白oprD2基因,14种氨基糖苷类修饰酶基因,7种16SrRNA甲基化酶基因和7种可移动遗传元件遗传标志,再对检测结果作样本聚类分析.结果:20株泛耐药铜绿假单胞菌共检出5种β-内酰胺类耐药相关基因(TEM-1、CARB、KPC、OXA-10群、oprD2突变),5种氨基糖苷类耐药相关基因[aac(6’)-Ⅰb、aac(6')-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、ant(3”)-Ⅰ、rmtB],4种可移动遗传元件的遗传标志(int Ⅰ 1、tnp513、IS26、merA).样本聚类分析把本组菌分为4个可操作分类单元.其中2号株簇群包含了16个成员均携带了TEM、CARB、aac(6’)-Ⅰ b、aac(6’)-Ⅱ、ant(2”)-Ⅰ、rmtB、int Ⅰ 1、tnp513、IS26、merA基因,并存在oprD2缺失,为克隆传播暴发.结论:尽管本组泛耐药铜绿假单胞菌菌株药敏表型相同,但样本聚类分析仍可分辨出4个可操作分类单元,其中2号株簇群为克隆传播暴发.获得菌株之间的亲缘关系对院内感染实时监测和控制院内感染意义重大.
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携带blaKPC-2基因泛耐药肺炎克雷伯菌可移动遗传元件分析
目的 了解临床分离的携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中可移动遗传元件(mobile genetic elements,MGEs)存在情况.方法 在2008年11月至2009年7月从住院患者中分离19株携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌,通过分析3种基因gyrA、parC和mdfA序列对菌株进行分子鉴定.采用PCR方法检测4种可移动遗传元件遗传标记基因,分别为:泛宿主性接合性质粒遗传标记trbC、转座子Tn1548遗传标记tnpU、Ⅰ类整合子遗传标记qacE△1-sul1和插入序列共同区遗传标记ISCR1基因;对扩增阳性的4种遗传标记基因PCR产物采用双向测序,测序结果用Chromas软件直接作BLASTSearch比对分析.结果 本组19株gyrA、parC和mdfA基因PCR扩增均阳性,其基因序列经GenBank中的BLASTn程序进行同源性比较分析,证实19株均为肺炎克雷伯菌.19株中,4种可移动遗传元件遗传标记trbC、tnpU、qacE△1-sul1和ISCR1基因阳性率均为100.0％,经对该4种遗传标记基因PCR阳性产物进行测序比对,发现与GenBank中己发布的4种相对应基因trbC、tnpU、qacE△1-sul1和ISCR1序列完全相同(同源性均为100.0％),均得到确认.结论 可移动遗传元件在携带blaKPC-2型碳青霉烯酶基因泛耐药肺炎克雷伯菌中广泛存在.
