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益气扶正复方联合依维莫司对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468的增殖抑制作用及其对Akt/mTOR信号通路的影响
目的 探讨益气扶正复方(简称复方)联合依维莫司对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞的增殖抑制作用及Akt/mTOR信号通路的影响.方法 高效液相色谱法(HPLC)制备益气扶正复方药物,以MTT比色法分别检测10,20,40,80,160 mg· mL-1复方药物及1,10,100,1000 nmol· L-1依维莫司(Everolimus) 12,24,48 h对MDA-MB-468细胞的增殖抑制作用;分别运用IC50浓度的复方40 mg· mL-1与Everolimus 100 nmol· L-1单独及联合干预MDA-MB-468乳腺癌细胞48 h,观察其对细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪检测其对细胞周期和凋亡的影响;Western blot法检测其对细胞Akt/mTOR信号通路的影响.结果 复方及Everolimus均呈剂量、时间依赖性地抑制了MDA-MB-468乳腺癌细胞增殖,选择IC50浓度的复方40 mg· mL-1与Everolimus 100 nmol· L-1单独及联合干预细胞,联合用药组显著抑制了MDA-MB-468乳腺癌细胞的增殖,同时联合用药组抑制了p-mTOR和p-Akt的活性,提高了PTEN的表达.结论 复方与Everolimus均能抑制MDA-MB-468乳腺癌细胞增殖,两药联用效果更为显著,其作用机制可能与复方与依维莫斯联用抑制了p-mTOR和p-Akt的活性,提高了PTEN的表达有关.
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冬凌草甲素对白血病细胞增殖抑制及机制的研究
目的:探讨伊马替尼耐药的K562细胞(K562-R)的可能耐药机制及冬凌草甲素(oridonin,OR)对伊马替尼敏感的K562细胞(K562-S)和K562-R细胞的生长抑制作用及其可能机制.方法:Western blot法检测K562-S和K562-R细胞内p-Lyn的表达;采用改良的四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测OR对K562-S和K562-R细胞的增殖抑制作用,光学显微镜观察OR作用24 h后K562-S和K562-R细胞的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测OR对K562-S和K562-R细胞内BCL-2的表达和蛋白激酶p-Lyn、Akt/mTOR信号通路的变化.结果:在K562-R细胞中,p-Lyn表达增高.OR对K562-S和K562-R细胞的生长具有抑制作用,且呈时间和浓度依赖性,OR作用72 h的半抑制浓度(IC50)值分别为4.23±1.30和4.97±2.23 μmol/L.OR作用24 h后,K562-S和K562-R细胞破坏明显,部分细胞裂解成碎片.流式细胞仪检测发现,OR使K562-S和K562-R凋亡细胞明显增多.Westemblot结果提示,OR使细胞内蛋白激酶p-Lyn表达下降,Akt/mTOR信号通路关键点蛋白磷酸化水平明显减低,凋亡抑制蛋白BCL-2表达下调.结论:p-Lyn高表达可能参与K562-R细胞的耐药.OR通过下调p-Lyn,抑制Akt/mTOR信号通路和下调BCL-2表达,促进细胞凋亡,抑制白血病细胞株K562-S和K562-R的生长.
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shRNA沉默NSD2基因表达对OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响
目的:探讨干扰shRNA下调NSD2基因表达对弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖、凋亡及Akt/mTOR信号通路的影响.方法:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞,应用real time Q-PCR检测NSD2mRNA的表达和Western blot法检测NSD2蛋白的表达,以鉴定NSD2 shRNA的沉默效果,应用CCK-8试验检测细胞增殖,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot测定组蛋白H3K36二甲基化水平(H3 K36me2)、BAX BCL-2、caspase-3、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR (p-mTOR)、磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶(phos-phorylation P70 ribosomal protein S6 kinase,p-P70S6K)的变化.结果:NSD2 shRNA慢病毒转染OCI-Ly3细胞72 h后,real time Q-PCR和Western blot检测显示NSD2的mRNA和蛋白表达均有明显下降(P＜0.05),NSD2 shRNA组细胞增殖率明显低于对照和Neg shRNA组(P＜0.05),NSD2 shRNA组细胞的凋亡率明显高于对照组和和NegshRNA组(30.37±4.22)％vs(1.36±0.52)％和(2.17±1.43)％(P ＜0.05);促凋亡蛋白BAX表达上调,抑制凋亡蛋白BCL-2表达下调,caspase-3表达上调;H3 K36me2水平较对照组明显下降,而检测Akt/mTOR通路蛋白发现,Akt总蛋白水平未明显下降,但是活性形式的磷酸化p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K表达下调.结论:干扰沉默NSD2基因可抑制弥漫大B细胞淋巴瘤OCI-Ly3细胞增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能是调节组蛋白H3 K36 me2水平变化,特异性地抑制Akt/mTOR信号通路的活性.
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雷帕霉素在溃疡性结肠炎患者中应用的临床价值评估
目的:研究雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路抑制剂雷帕霉素在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)中的抗炎及抑制癌变的临床价值评估.方法:我院55例UC患者,35例通过在口服美沙拉嗪的基础上加用雷帕霉素治疗10d后,对照组20例为口服美沙拉嗪的基础上加用安慰剂,观察电子结肠镜下溃疡面在治疗前后愈合比较,并检测治疗前后黏膜核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、环氧化酶2(cyclooxygenase 2,Cox2)表达变化,血清促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factoralpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及抑炎因子IL-10变化,同时检测治疗前后抑癌基因PTEN、PHL PP、Rb的表达变化.结果:实验组有1例患者出现口腔溃疡,2例患者因出现腹痛、排黏液脓血便加重而终止,余32例完成该研究,与对照组治疗比较,其中结肠镜下可见治疗后溃疡面明显减少,局部黏膜愈合较快;黏膜核因子NF-κB(0.116±0.026)、Cox2(0.035±0.12)、促炎因子IL-6(13.25±3.78)表达量明显减低(P＜0.05),抑炎因子IL-10(67.23±5.03)检测量增高(P＜0.01),抑癌基因PTEN(0.212±0.18)、PHLPP(0.312±0.43)、Rb(0.285±0.15)表达水平明显增高(P＜0.01),血清TNF-α(19.24±3.25)无统计学意义.结论:雷帕霉素作为免疫抑制剂联合美沙拉嗪可减轻UC炎症反应;并可通过抑制Akt/mTOR通路预防UC黏膜癌变.
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温经止痛方对子宫内膜异位症模型大鼠AKT/mTOR信号通路的影响
目的 探讨温经止痛方对子宫内膜异位症(endometriosis,EMS)模型大鼠AKT/mTOR通路相关分子表达的影响.方法 将建模成功的75只雌性成熟Wistar大鼠随机分为5组,加假手术组共6组,各15只,分别给予温经止痛方中药高、中、低剂量、内美通(孕三烯酮)胶囊、生理盐水灌胃给药.Real-time PCR、免疫组化法测异位、在位内膜上AKT、mTOR mRNA和蛋白表达.ELISA法检测血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量.结果 子宫内膜异位症模型大鼠在位、异位内膜上AKT及mTOR mRNA及其蛋白含量显著高于正常对照组(P<0.01),中药高剂量组、西药(孕三烯酮)组在位、异位内膜AKT、mTOR mRNA表达含量明显低于造模组(P<0.05),EMS模型组血清VEGF水平均高于正常对照组(P<0.01).温阳化瘀法中药高、低剂量组、西药组血清VEGF水平明显低于模型组(P<0.01);中药中剂量组亦低于模型组(P<0.05).结论 子宫内膜异位症发生与AKT/mTOR信号通路、以及VEGF表达水平有关.温经止痛方可有效抑制AKT/mTOR信号通路,降低血清VEGF的表达,从而抑制异位内膜的粘附、侵袭、血管生成.
关键词： 子宫内膜异位症 Akt/mTOR信号通路 血管内皮生长因子 中医药 大鼠 -
EPHA2通过增强Akt/mTOR信号通路促进SGC-7901细胞的增殖
背景与目的：EPHA2能够促进胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程，从而增强胃癌细胞的增殖能力，但EPHA2调控胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程的分子机制依然不明确。Akt/mTOR信号通路能够通过促进胃癌细胞中Cyclin D1的表达及胃癌细胞的细胞周期进程增强胃癌细胞的增殖能力，且有研究表明EPHA2能够激活Akt/mTOR信号通路。基于此，该研究探讨了Akt/mTOR信号通路在EPHA2促胃癌细胞增殖中的作用。方法：采用蛋白[质]印迹法(Western blot)检测过表达EPHA2和敲低EPHA2表达对SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1磷酸化的影响。使用Akt抑制剂MK2206和mTOR抑制剂RAD001分别处理转染空载体病毒的SGC-7901-NC细胞和过表达EPHA2的SGC-7901-EPHA2细胞，分别通过CCK8、流式细胞术和Western blot检测细胞增殖、细胞周期及周期相关蛋白Cyclin D1的表达。结果：过表达EPHA2增强SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化，敲低EPHA2的表达抑制SGC-7901细胞中Akt、mTOR和4EBP1的磷酸化。MK2206和RAD001处理细胞时，EPHA2过表达对SGC-7901细胞增殖、细胞S期和Cyclin D1表达的促进作用被显著抑制。结论：EPHA2通过增强Akt/mTOR信号通路促进胃癌细胞SGC-7901的增殖能力，提示我们将来针对EPHA2高表达的胃癌患者或许可以采用Akt抑制剂和mTOR抑制剂予以个体化治疗。
关键词： EphA2 Akt/mTOR信号通路 胃癌 SGC-7901细胞 -
OTUD7B在急性髓系白血病细胞中的功能及机制
目的·探讨OTUD7B在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中的生物学效应与作用机制.方法·检测AML患者外周血单个核细胞中OTUD7B基因的表达和AML患者骨髓单个核细胞中OTUD7B蛋白的表达.利用TCGA数据库验证OTUD7B与AML患者生存期的关系.构建M2型AML小鼠模型,检测模型小鼠骨髓、脾脏和肝脏中OTUD7B的表达.在白血病细胞株HL60和kasumi1中过表达OTUD7B,检测OTUD7B蛋白对细胞活率及细胞周期的影响;在稳定表达OTUD7B的HL60和kasumi1细胞株中,检测AKT/mTOR通路蛋白的变化;过表达AKT1后检测OTUD7B引起的细胞生长抑制的变化.结果·OTUD7B在各个类型AML患者原代细胞中表达量均较低.OTUD7B表达量与AML患者的生存期密切相关.与野生型小鼠比较,M2型AML小鼠骨髓、肝脏及脾脏中OTUD7B的表达量均较低.HL60和kasumi1细胞中过表达OTUD7B能够显著抑制细胞活率,降低S期细胞的比例,并显著抑制AKT和mTOR蛋白的磷酸化;过表达AKT1后能够部分逆转OTUD7B对细胞的生长抑制作用.结论·OTUD7B在原代AML患者细胞及M2型AML小鼠的骨髓、肝脏和脾脏中低表达,并且OTUD7B表达量低的患者生存期更短.OTUD7B过表达能明显抑制AML细胞HL60和kasumi1的细胞活率,并且显著抑制细胞进入S期.OTUD7B过表达对AML细胞的抑制效应可能与抑制AKT/mTOR信号通路的活化有关.
关键词： OTUD7B 急性髓系白血病 增殖抑制 Akt/mTOR信号通路 -
沉默PGAM1基因对食管癌细胞生物学功能的影响
目的 探讨沉默磷酸甘油酸变位酶1( PGAM1)基因对食管癌细胞生物学功能的影响及可能机制.方法收集2016年7月至2017年6月间在我院行手术切除的67例食管癌及对应癌旁正常组织,采用免疫组化SP法检测PGAM1表达并分析其表达与临床病理特征的关系. PGAM1 shRNA(shPGAM1组)或shRNA?NC(NC组)转染至食管癌Eca?109细胞,分析PGAM1基因沉默对Eca?109细胞凋亡和增殖的影响.采用实时荧光定量PCR(QPCR)和Western blotting法检测PGAM1对Akt／mTOR信号通路关键分子的影响.结果 食管癌组织中PGAM1高表达率为58. 2%(39／67),高于癌旁组织的31. 3%(21／67),差异有统计学意义(P＜0. 05). PGAM1表达与临床分期、分化程度、浸润深度有关(P＜0. 05),而与年龄、性别、淋巴结转移等无关(P＞0. 05). shPGAM1组和NC组中PGAM1 mRNA表达量分别为0. 48±0. 10和1. 01±0. 14,差异有统计学意义(P＜0. 05). MTT法检测结果显示,培养24、48、72、96 h后,shPGAM1组Eca?109细胞增殖率分别为(87. 65±7. 42)%、(79. 34± 9. 11)%、(70. 17±6. 84)%、(60. 36±7. 95)%,明显低于NC组,差异有统计学意义(P＜0. 05). 48 h后shPGAM1组和NC组的Eca?109细胞凋亡率分别为(45. 36±5. 38)%和(24. 81±4. 67)%,差异有统计学意义(P＜0. 05);shPGAM1组和NC组Eca?109细胞培养上清的葡萄糖消耗量分别为(56. 84±11. 35)%和(99. 87±10. 48)%,shPGAM1组和NC组Eca?109细胞培养上清的乳酸含量分别为(48. 02±10. 18)%和(99. 00±12. 35)%,差异均有统计学意义(P＜0. 05). shPGAM1组细胞的PTEN表达量高于NC组(P＜0. 05),而p?Akt、p?mTOR表达量均低于NC组(P＜0. 05).结论 PGAM1高表达与食管癌的发生、发展有关,通过激活Akt／mTOR信号通路诱导的Warburg效应,促使肿瘤细胞增殖,抑制其凋亡.
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PGAM1通过激活Warburg效应调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制研究
目的 探讨磷酸甘油酸变位酶1(PGAM1)在宫颈癌组织中的表达情况以及可能的生物学机制.方法 收集行手术切除的67例宫颈癌患者的新鲜宫颈癌组织及癌旁正常组织,采用免疫组化法检测PGAM1的表达情况并分析与患者病理特征的关系.构建PGAM1基因沉默稳转Hela宫颈癌细胞株,分析PGAM1基因沉默对Hela细胞凋亡和增殖活性的影响.采用qRT-PCR和Westem blot法检测PGAM1对Akt/mTOR信号通路关键分子的影响.结果 ①宫颈癌组织中PGAM1高表达率为58.21％,明显高于癌旁组织(P＜0.05).②不同临床分期、分化程度、浸润深度的患者宫颈癌组织中PGAM1的高表达率差异有统计学意义(P＜0.05).③Hela细胞shPGAM1基因沉默后,细胞凋亡率较空白对照组(NC组)明显增加,细胞增殖活性明显降低(P＜0.05).④Hela细胞shPGAMl基因沉默后,与NC组比较,PTEN mRNA和蛋白相对表达量明显上调,而p-Akt、p-mTORmRNA和蛋白相对表达量明显降低(P＜0.05).结论 肿瘤组织PGAM1蛋白高表达与宫颈癌的发生、发展有关,通过激活Akt/mTOR信号通路诱导的Waburg效应,促使肿瘤细胞的增殖,抑制其凋亡.
关键词： 磷酸甘油酸变位酶1 宫颈癌 Warburg效应 糖代谢 Akt/mTOR信号通路 -
珍珠梅黄酮纳米粒通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞凋亡的研究
目的 探讨珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌SMMC-7721细胞体外生长的抑制作用及其作用机制.方法 不同浓度的珍珠梅黄酮纳米粒(40,80,120μmol·L-1)处理SMMC-7721细胞后,采用MTT法检测珍珠梅黄酮纳米粒对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色法观察SMMC-7721细胞凋亡的形态学变化;利用Annexin/PI双标记法检测细胞凋亡率;Western blot检测SMMC-7721细胞中Akt,mTOR,p-Akt,p-mTOR及active-caspase3蛋白表达.结果 珍珠梅黄酮纳米粒能显著抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有剂量依赖性;显著降低p-Akt和p-mTOR蛋白表达.结论 珍珠梅黄酮纳米粒具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖及诱导凋亡的作用,其作用机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路有关.
关键词： 珍珠梅 SMMC-7721 Akt/mTOR信号通路 细胞凋亡 -
华蟾毒精抑制人肝癌细胞株增殖、促凋亡作用及机制探讨
目的:观察华蟾毒精对人肝癌细胞株增殖抑制及促凋亡作用,并探讨其机制.方法:选取人肝癌细胞HepG2进行培养,取对数生长期HepG2细胞分为实验组1(浓度为25 μmol/L华蟾毒精处理)、实验组2(浓度为50μmol/L华蟾毒精处理)、实验组3(浓度为100μmol/L华蟾毒精处理)和对照组(加等体积的生理盐水),培养24h、48h后采用MTT法和流式细胞术检测对照组和实验组肝癌细胞HepG2增殖抑制率和凋亡率.培养48h后荧光定量PCR检测AKT、mTOR、Caspase3、Bax和Bcl-2 mRNA表达量,免疫印迹法检测Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达量.结果:培养24h、48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞增殖抑制率均显著高于对照组(P＜0.05),且实验组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);培养24h、48h实验组1、实验组2和实验组3细胞凋亡率均显著高于对照组(P＜0.05),实验组间两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05);培养48h,实验组1、实验组2和实验组3细胞AKT、mTOR、Bcl-2 mRNA表达量与对照组相比均显著降低(P＜0.05),Bax和Caspase-3 mRNA表达量均显著增加(P＜0.05),且实验组Caspase3、Bax和Bcl-2蛋白表达与mRNA表达结果趋势一致.结论:华蟾毒精能够抑制肝癌细胞HepG2增殖,并促进其凋亡,作用机制可能与通过下调Bcl-2蛋白和上调Bax、Caspase-3蛋白的表达,调控AKT/mTOR信号通路有关.
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GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖和侵袭能力的影响
目的 探讨过表达/沉默GSTP1基因对人肝癌细胞系HepG2增殖及侵袭能力的影响.方法 采用腺病毒载体转染人肝癌细胞系HepG2,获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞.实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞中GSTPl mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞的细胞活力和侵袭能力;免疫印迹法(Western blot)检测细胞中Akt、mTOR、p-Akt和p-mTOR的蛋白表达.结果 经腺病毒载体转染后,成功获得过表达/沉默GSTP1基因的HepG2细胞;过表达GSTP1基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力显著降低(P＜0.05),而沉默GSTP1基因后,HepG2细胞的细胞活力和侵袭能力则显著增高(P＜0.05);过表达GSTP1基因后,p-Akt和p-mTOR的蛋白表达水平显著降低(P＜0.05),而沉默GSTP1基因的结果则相反.结论 过表达GSTP1基因可抑制HepG2细胞的增殖和侵袭能力,沉默GSTP1基因则促进HepG2细胞的增殖和侵袭能力,其作用机制可能与Akt/mTOR信号通路有关.
关键词： GSTP1 HepG2细胞 增殖 侵袭 Akt/mTOR信号通路 -
丹参酮ⅡA对白血病细胞株K562增殖抑制及机制研究
目的 探讨丹参酮ⅡA(TAT)对入白血病细胞株K562的生长抑制作用及其可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测TAT(终浓度1、10、15、30、50 μmol/L)对K562细胞的增殖抑制作用,光学显微镜观察TAT(30μmol/L)作用24 h后K562细胞的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡蛋白BCL-2、BAX的表达和蛋白激酶AKT/mTOR信号通路的变化.结果 终浓度为10～50 μmol/L的TAT对K562细胞的生长具有抑制作用,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05),TAT作用K562细胞96 h的半数抑制浓度(IC50)值为(7.75±2.47) μmol/L.30 μmol/L TAT作用K562细胞24 h后显微镜下显示细胞破坏明显,部分细胞裂解成碎片.流式细胞仪检测发现30 μmol/L TAT作用组凋亡细胞明显增多(P＜0.05).Westernblot结果提示,30 μmol/L TAT作用K562细胞后AKT、mTOR、p70S6K、4-EBP1等信号通路关键点蛋白磷酸化表达水平减低,凋亡抑制蛋白BCL-2下调,而促凋亡蛋白BAX上调.结论 TAT通过抑制AKT/m-TOR信号通路,下调BCL-2和上调BAX的表达,促进细胞凋亡,抑制白血病细胞株K562的生长.
关键词： 丹参酮ⅡA 白血病细胞株K562 凋亡 Akt/mTOR信号通路 -
Prucalopride通过促进自噬抑制胶质瘤细胞U251增殖
目的:研究Prucalopride对胶质瘤U251细胞增殖、自噬、凋亡的影响,并探讨其相关信号通路.方法:通过CCK8检测细胞增殖的变化;Transwell检测迁移和侵袭的变化;细胞流式实验、Western blot检测细胞凋亡的变化;Western blot检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1、p62的表达;AKT/mTOR通路相关蛋白的变化.结果:CCK8显示Prucalopride显著抑制U251细胞的增殖(P<0.05);Transwell侵袭实验显示Prucalopride可以抑制脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭(P<0.05);细胞流式实验显示 Prucalopride促进 U251细胞的凋亡(P<0.05),Prucalopride处理后细胞凋亡相关蛋白Bax、Active Caspase3水平升高,Bcl-2表达降低;自噬相关蛋LC3、Beclin1表达上调,p62表达下调;p-AKT蛋白和p-mTOR蛋白水平显著降低.结论:Prucalopride通过抑制AKT/mTOR信号通路激活自噬抑制U251细胞增殖和迁移,促进其凋亡.
关键词： Prucalopride 脑胶质细胞瘤 自噬 Akt/mTOR信号通路
