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热毒宁拆方对RAW 264.7细胞炎症相关因子表达的影响
目的:本研究主要观察热毒宁及其拆方对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7炎症模型分泌促炎因子的影响,探讨热毒宁及其拆方的抗炎作用.方法:体外培养RAW 264.7细胞,热毒宁及其拆方作用于未经刺激的RAW 264.7细胞及LPS (1 mg·L-1)刺激后的RAW 264.7细胞,将细胞分为空白对照组、LPS模型组、给药组组,采用噻唑蓝(MTT)法检测不同相对RAW 264.7细胞增殖活力,硝酸还原酶法测定细胞上清液中一氧化氮(N0)的含量,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)的分泌量.结果:与LPS模型组比较,各提取物组,NO、TNF-α、PGE2的表达明显降低;3种不同药材提取物之间比较,青蒿对PGE2的抑制作用较为明显,栀子对TNF-α的抑制较为明显,金银花对NO的抑制作用较为明显,且药材提取物之间有协同作用,热毒宁组合对PGE2、TNF-α、NO的抑制作用强.结论:青蒿、栀子、金银花提取物均能明显拮抗LPS所致的RAW 264.7细胞炎症反应;不同提取物组合的抗炎作用有差异,热毒宁组合的抗炎作用强.
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青娥方含药血清对破骨细胞前体RAW264.7细胞FAK/Src/p130Cas通路及上清液炎症因子的影响
目的 观察青娥方含药血清对破骨细胞前体RAW 264.7细胞FA K/Sr c/p130 Cas通路相关基因蛋白表达及上清液炎症因子的影响.方法 制备青娥方含药血清和生理盐水血清,分别干预体外培养的破骨细胞前体RAW 264.7细胞.干预12h和24 h后,提取mRNA和蛋白,荧光定量PCR(qPCR)检测FAK/Src/p130Cas及下游信号关键因子CRK、C3G和RAS mRNA表达的变化,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测FAK/Src/p130Cas及下游信号关键因子CRK、C3G和RAS蛋白表达的变化;应用ELISA法检测细胞上清液IL-6、TNF-α、PGE2含量.结果 与同期生理盐水血清组比较,青娥方含药血清组FAK、Src、p130 Cas、CRK、C3G和RAS的RNA和蛋白表达均明显减少(P ＜0.05,P＜0.01),以FAK、Src、p130Cas下降为显著,而细胞上清液炎症因子IL-6,TNF-α和PGE2含量明显下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 青娥方含药血清能够下调FAK/Src/p130Cas及其下游信号分子的表达,抑制RAW 264.7细胞分泌炎症因子,从而抑制RANKL+ MCSF诱导的破骨细胞分化.
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细胞胆固醇外流率的测定以及细胞外胆固醇和脂多糖对其的抑制作用
背景：胆固醇与动脉粥样硬化等疾病的发生、发展密切相关。目前研究细胞胆固醇动态变化的方法有局限性。
目的：通过BODIPY-Cholesterol标记RAW 264.7小鼠巨噬细胞，检测细胞胆固醇的外流率，并研究细胞外胆固醇浓度和脂多糖对其的影响。
方法：RAW264.7细胞采用含有体积分数10%FBS的DMEM培养基体外培养，再用0.025 mmol/L的BODIPY-Cholesterol标记细胞1，2，4，8 h，以无血清DMEM洗涤细胞后，再孵育细胞6，12，24，48，96 h，优化标记细胞的时间及孵育时间。分别采用胆固醇、脂多糖、异常高胆固醇人血清和正常胆固醇人血清处理细胞，再对其胆固醇外流率进行测定和比较。
结果与结论：BODIPY-Cholesterol标记细胞2-8 h后，测定胆固醇外流率的结果较好。RAW 264.7小鼠巨噬细胞经过BODIPY-Cholesterol荧光染料标记2 h后，测定胆固醇外流率，发现其随外加胆固醇浓度(0.1，0.5，2.5 mmol/L)的增大呈递减趋势(P<0.01)。脂多糖刺激后细胞的胆固醇外流率降低(P<0.05)。采用高胆固醇人血清处理细胞后，胆固醇的外流率降低(P<0.05)。结果说明，利用BODIPY-Cholesterol可以定量测定细胞胆固醇外流率，并能研究环境中胆固醇和脂多糖对其的影响。 -
淫羊藿甙对体外钛微粒诱导破骨细胞骨吸收功能的影响
目的:探讨淫羊藿甙对钛微粒诱导的体外培养的破骨细胞骨吸收功能的影响.方法:用巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-kB ligan,RANKL)诱导破骨细胞前体RAW 264.7细胞为破骨细胞,MTT法检测不同浓度淫羊藿甙对RAW 264.7细胞增殖的影响,得出佳浓度.实验分为正常培养基的钛微粒处理组、含淫羊藿甙的钛微粒处理组和空白对照组,48h后收集细胞,采用ELISA法检测培养液中细胞核因子kB活化因子受体的浓度(receptor activator of NF-kB,RANK),用实时荧光定量PCR法检测抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)、基质外金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)、碳酸酐酶Ⅱ(carbonic anhydraseⅡ,CAⅡ)、组织蛋白酶K(Cathepsin K,CtsK)mRNA的表达；Western Blot法检测TRAP、RANK、CtsK蛋白的表达.设置同样的实验组与骨磨片共培养,甲苯胺蓝染色计算骨吸收陷窝的数目和面积.结果:淫羊藿甙可明显下调钛微粒诱导的RAW 264.7细胞和细胞液中RANK的表达,TRAP、MMP-9、CAⅡ、CtsKmRNA和蛋白的表达,并减少骨磨片上骨吸收陷窝的数目和面积.结论:淫羊藿甙可抑制钛颗粒体外诱导破骨细胞的骨吸收,有望成为防治人工关节无菌性松动的药物.
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烧伤脓毒症大鼠血清培养巨噬细胞中Nrf2的表达
目的 研究内毒素和烧伤脓毒症大鼠血清培养的巨噬细胞中Nrf2的表达.方法 在动物模型中,将大鼠分为正常对照组、LPS组、单纯烧伤组、烧伤合并铜绿假单胞菌脓毒症组、烧伤合并金黄色葡萄球菌脓毒症组.先将后4组制备成40％面积的Ⅲ度烧伤创面,分别将金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌及LPS注入大鼠腹腔内,在验证脓毒症动物模型后,感染8h心脏穿刺收集血液制备血清备用.然后取RAW 264.7细胞为靶细胞,以不同组血清干扰8h后,分别运用RT-PCR和Western blotting技术检测Nrf2在靶细胞中的表达情况.结果 所有组Nrf2明显高于正常对照组.RT-PCR示Nrf2 mRNA表达水平在单纯烧伤组中高(P＜0.01),其次分别是内毒素组(P＜0.01)、假单胞菌组(P＜0.01)和葡萄球菌组(P＜0.01).Western印记示Nrf2蛋白表达在内毒素组中高(P＜0.01),其后分别是单纯烧伤组(P＜0.01)、绿脓杆菌和葡萄球菌组(P＜0.05).结论 当受到细菌或内毒素及内源性抗氧化系统对抗氧化应激损害干扰后,内源性抗氧化系统出现于巨噬细胞RAW264.7中,并可能作为治疗目标应用于严重烧伤合并MODS、脓毒症休克等患者中.
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伊立替康对RAW 264.7巨噬细胞增殖和细胞凋亡的影响
目的 分析抗肿瘤药伊立替康(CPT-11)对RAW 264.7巨噬细胞增殖及细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法 WST-1法检测CPT-11对RAW 264.7细胞增殖的作用,倒置显微镜观察CPT-11对RAW 264.7细胞形态的影响,Hoechst 33342染细胞核观察RAW 254.7细胞的核形态,流式细胞术检测亚二倍体(凋亡峰)的变化,免疫印迹法检测Caspase-3活化、PARP及细胞周期相关蛋白的变化.结果 CPT-11能明显抑制RAW 264.7细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性.在CPT-11作用下RAW 254.7细胞体积增大,细胞核增大,部分细胞发生核碎裂(细胞凋亡),并且原本贴壁生长、具有伪足的细胞变圆脱落.流式细胞术结果也显示,CPT-11可诱导RAW 264.7细胞产生亚二倍体峰(凋亡细胞),且细胞凋亡率呈浓度依赖性上升.同时,处于G2/M期细胞也明显增多,且呈浓度依赖性.免疫印迹分析显示,CPT-11可活化Caspase-3,使PARP水平下降,同时上调细胞周期蛋白Cyclin B1,下调Cyclin D1的表达.结论 伊立替康通过诱导细胞周期阻滞而抑制RAW 264.7细胞增殖,通过激活Caspase-3通路诱导细胞凋亡.
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重组大鼠△N△C/VEGF-C/Cys152Ser逆转录病毒载体的构建及表达
目的:构建重组大鼠△N△C/VEGF-C/Cys152Ser (ddVEGF-C)逆转录病毒载体,建立稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,并验证其表达.方法:利用PCR从pSecTag-ddVEGF-C中获取大鼠ddVEGF-C基因,克隆到pLPCX逆转录病毒载体,经PCR、双酶切和测序验证,转染PT67包装细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达目的基因的包装细胞株,用反转录PCR(RT-pCR)和Western blot方法验证其在RAW 264.7细胞中的表达.结果:构建的pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体经双酶切和PCR鉴定正确,测序结果与ddVEGF-C序列一致,病毒滴度为2 × 107 CFU/mL,RT-PCR和Western blot结果提示重组病毒感染RAW264.7细胞能正确表达ddVEGF-C.结论:成功构建了pLPCX-ddVEGF-C逆转录病毒载体,并建立了稳定表达ddVEGF-C的PT67包装细胞株,为以VEGF-C基础的实验研究提供了新工具.
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唑来膦酸对钛微粒诱导的破骨细胞前体细胞RAW 264.7分化的影响
目的：观察唑来膦酸对钛微粒诱导的破骨细胞前体细胞RAW 264.7分化的影响，探讨其防治假体周围骨质疏松的可能性。方法：体外培养单核巨噬细胞白血病细胞RAW 264.7。制备钛微粒， MTT法检测绘制RAW 264.7细胞增殖曲线，寻找唑来膦酸佳干预浓度。将RAW 264.7分为3组：Ti微粒组（0.1%体积比钛微粒+含质量分数为10%的胎牛血清培养基）、Ti+唑来膦酸组（0.1%体积比钛微粒+含质量分数为10%的胎牛血清培养基+佳浓度唑来膦酸）和对照组（含质量分数为10%的胎牛血清的常规培养基）。采用抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase,TRAP）染色法观察细胞的形态。采用ELISA法检测培养液中细胞核因子κB活化因子受体（receptor activator of NF-κB,RANK）的浓度，生化法测定细胞上清液中TRAP活力，用qPCR法检测TRAP、基质外金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、碳酸酐酶Ⅱ（carbonic anhydraseⅡ,CAⅡ）、磷酸酶-活化T细胞核因子（NFATcl） mRNA的表达；Western Blot法检测TRAP、RANK、CtsK蛋白的表达。结果：钛微粒能刺激RAW 264.7分泌促破骨细胞分化的因子，并能促进单核细胞向破骨细胞转化。唑来膦酸可明显下调钛微粒诱导的RAW 264.7RANK的表达，以及TRAP、MMP-9、CAⅡ、NFATclmRNA和蛋白的表达，差异有统计学意义（P <0.05）。结论：唑来膦酸能有效抑制破骨细胞前体细胞RAW 264.7分化，减少破骨细胞的形成，下调RANK、TRAP等破骨细胞特异细胞表型和功能基因mRNA的转录水平，有望成为防治人工关节置换术后假体周围骨质疏松的药物。
