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镇肝熄风汤含药血清激活Nrf2/ARE信号通路对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激的保护作用
目的:研究镇肝熄风汤含药血清对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)致PC12细胞氧化应激的保护作用及其相关机制.方法:应用镇肝熄风汤低剂量(8 g·kg-1)、中剂量(16 g·kg-1)和高剂量组(32 g·kg-1)大鼠的含药血清或空白血清预处理PC12细胞1h后,加100 μM 6-OHDA共孵育24 h后收集细胞.二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)荧光探针染色法结合荧光酶标仪检测活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平,采用实时定量PCR检测核转录因子E2相关因子2(Nuclear Factor-erythroid 2 Related Factor2,Nfe2l2))基因Nfe2l2、血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1,HO-1)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamate-CysteineLigase Catalyticsubunit,GCLc)和调节亚基(GCLm)mRNA表达.采用荧光素酶报告基因系统检测抗氧化反应元件(Antioxidant Response Element,ARE)活性.结果:镇肝熄风汤含药血清抑制了6-OHDA诱导的氧化应激,上调了6-OHDA处理细胞中Nfe2l2、HO-1和GCLc mRNA表达,但是对GCLm mRNA表达没有显著影响.结论:镇肝熄风汤含药血清对6-OHDA诱导PC12细胞氧化应激具有保护作用,其机制可能与上调Nfe2l2 mRNA表达,使ARE激活进一步诱导其下游II相解毒酶基因和抗氧化酶基因HO-1和GCLc mRNA表达有关.
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利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株实验研究
目的 利用慢病毒载体建立过表达Nfe2l2基因的L929细胞株,为探讨Nfe2l2基因在结缔组织成纤维细胞细胞外基质(ECM)重构中的作用奠定实验基础.方法 2014年12月—2015年5月,通过双酶切将Nfe2l2目的基因连接到GV341载体(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin),经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV341载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-Nfe2l2,病毒感染L929细胞72 h后筛选稳定表达的细胞株L929/LV-Nfe2l2,采用Real-time qPCR测定Nfe2l2的表达.结果 经比对,构建的LV-Nfe2l2阳性克隆序列与目的基因Nfe2l2相符;L929细胞达到80％感染效率的佳感染条件为:在ENi.S培养基中进行感染,设定感染复数(MOI)为8～10,感染时间为72 h.Real-time qPCR结果显示,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞中Nfe2l2基因表达丰度为高(ΔCt值≤12).结论 本研究成功构建了一种过表达Nfe2l2基因的慢病毒载体;LV-Nfe2l2感染L929细胞后可实现目的基因的高表达,经筛选的L929/LV-Nfe2l2细胞株可用于后续实验研究.
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微小RNA-144-3p及其靶基因NFE2L2在宫颈癌中的表达及临床意义
目的 探讨微小RNA-144-3p(miR-144-3p)及其靶基因NFE2L2在宫颈癌中的表达及临床意义.方法 收集新乡医学院第三附属医院2013年1月至2015年12月手术切除的15例宫颈鳞状细胞癌患者的癌组织标本和癌旁组织标本.采用实时荧光定量聚合酶链反应检测宫颈癌组织和癌旁组织中miR-144-3p和NFE2L2 mRNA的相对表达量,采用Western blot检测宫颈癌组织和癌旁组织中NFE2L2蛋白的表达.分析miR-144-3p mRNA相对表达量与患者的年龄、临床分期、细胞分化程度及淋巴结转移的相关性.结果 宫颈癌组织和癌旁组织中miRNA-144-3p mRNA的相对表达量分别为0.56±0.20和1.04±0.33,宫颈癌组织中miR-144-3p mRNA的表达量低于癌旁组织(t=-8.38,P<0.05).miR-144-3p mRNA在宫颈癌组织中的表达与患者年龄无关(P>0.05),与细胞分化程度、临床分期和淋巴结是否转移有关(P<0.05).NFE2L2 mRNA在宫颈癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为4.41±1.61和0.88±0.10,NFE2L2蛋白在宫颈癌组织和癌旁组织中的相对表达量分别为0.29±0.04和0.15±0.03;NFE2L2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的相对表达量显著高于癌旁组织(t=216.31、-10.97,P<0.05).结论 miR-144-3p在宫颈癌组织中呈低表达,而其靶基因NFE2L2在宫颈癌组织中呈高表达,miR-144-3p低表达降低了对NFE2L2的抑制作用,进而促进肿瘤的发生和发展.
关键词： 宫颈癌 微小RNA-144-3p Nfe2l2 -
MiR-144-3p抑制NFE2L2的表达降低宫颈癌细胞的增殖和迁移
目的 研究miR-144-3P对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响,并初步探讨其作用机制.方法 通过瞬时转染miR-144-3p mimics(mimics组)、inhibitors (inhibitors组)和阴性对照(NC组)到宫颈癌Hela细胞中,以未干预Hela细胞为正常对照,CCK-8检测细胞增殖活性,Transwell检测细胞迁移能力,实时定量PCR和Western Blot检测细胞中NFE2L2的表达水平.结果 CCK-8结果显示,转染48 h后mimics组、inhibitors组和NC组的增殖率分别为(83.3±2.0)％、(113.1±0.8)％和(100.2±0.2)％,差异有统计学意义(P＜0.05);transwell小室的细胞数目分别为(78.3±3.5)、(109.3±4.2)和(96.0±4.0)个,差异有统计学意义(P＜0.05);实时定量PCR结果显示mimics组、inhibitors组和NC组NFE2L2的表达量分别为0.40±0.01、1.94±0.04和1.00±0.03,差异有统计学意义(P＜0.05);Western Blot显示各组NFE2L2的表达量差异有统计学意义(P＜0.05).结论 体外实验证实miR-144-3p能够抑制宫颈癌细胞的增殖和浸润,可能和抑制NFE2L2的表达有关.
关键词： 宫颈癌 miR-144-3p Nfe2l2 Hela细胞
