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基于EnVision多标记读板仪的细胞内钙信号检测技术的研究
目的 研究使用EnVision多标记读板仪检测细胞内钙信号的可行性.方法 分别用卡巴胆碱和凝血酶刺激LN229、SKN-MC细胞或者磷脂酶C抑制剂U73122预处理的LN229细胞,使用EnVision多标记读板仪检测细胞内钙信号强度的变化.结果 卡巴胆碱诱导的LN229细胞内钙信号变化呈现浓度依赖性;卡巴胆碱和凝血酶诱导的细胞内钙信号变化趋势不同;凝血酶诱导的钙信号变化具有细胞特异性;U73122对凝血酶诱导的钙信号的抑制作用呈现剂量依赖性.结论 EnVision多标记读板仪作为细胞内钙信号检测仪器,具有快速、可重复性好和灵敏度高等优势,适用于钙信号相关的研究和小分子抑制剂的筛选等领域的工作.
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G蛋白βγ亚基对G蛋白偶联受体磷酸化影响
G蛋白是质膜蛋白的一种,属于广泛存在的信号转导蛋白[1].G蛋白与具有7个跨膜结构的细胞膜受体偶联,介导复杂的细胞信号转导过程[2].
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安神定志灵对ADHD模型鼠前额叶、纹状体各G蛋白亚基表达的影响
目的:探讨中药复方安神定志灵对注意缺陷多动障碍动物模型SHR大鼠前额叶、纹状体中Gαs、Gαi及GolfmRNA和蛋白表达的影响.方法:将SHR大鼠运用随机区组分为模型组、利他林组、安神定志灵低剂量、中剂量、高剂量组,每组10只,另将10只WKY大鼠设为正常组.安神定志灵低、中、高剂量组分别按生药量6.7、13.4、26.7 g·kg-灌胃,每日2次;利他林组以2 mg·kg-1给予利他林灌胃,每日2次;模型组和正常对照组每日按体质量给予等量双蒸水灌胃,灌胃4周后处死.分别用RT-PCR和Western Blot检测各组大鼠前额叶、纹状体中Gαs、Golf及Gαi mRNA和蛋白的表达水平.结果:模型组大鼠除前额叶皮质Gαi蛋白外,余G蛋白亚基mRNA和蛋白表达水平均明显低于正常组(P＜0.05或P＜0.01).经治疗后,利他林组和安神定志灵各剂量组有提高前额叶皮质、纹状体中三种G蛋白亚基Gαi mR-NA和蛋白的表达水平趋势或能显著提高其表达水平(P＜0.05或P＜0.01).结论:安神定志灵可以升高SHR大鼠前额叶皮质、纹状体Gαs、Golf及Gαi三者mRNA和蛋白的表达水平,提示安神定志灵可以激活突触后膜多巴胺受体下游不同的G蛋白亚基,进而影响下游的信号通路从而发挥治疗作用.
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血管紧张素(1～7)受体mas稳定转染细胞株的构建及mas激活对于ERK1/2信号通路的调节
背景:近几年有关mas基因与心血管疾病的关系成为研究的热点,但有关血管紧张素(1～7)-mas轴在调节心血管功能及在心血管疾病发病过程中发挥作用的信号转导途径还不甚清楚.目的:实验拟构建血管紧张素(1～7)受体mas稳定转染细胞株及mas基因表达和活化对ERK MAPK信号通路的影响.设计、时间及地点:重复测量设计,实验于2006-07/2008-03在首都医科大学生物化学与分子生物学实验室完成.材料:人mas全长cDNA,原核表达载体pEGFP C2,菌株E.coli DH5 α,COS-7细胞均由s本实验室保存.方法:将mas cDNA克隆到真核表达载体pEGFP C2中,构建重组质粒pEGFP-mas.再将重组质粒转染COS-7细胞,筛选稳定表达细胞株.主要观察指标:经血管紧张素(1～7)刺激后,检测稳定转染mas的COS-7细胞中ERK磷酸化水平变化.结果:与对照组相比,稳定转染mas的COS-7细胞经血管紧张素(1～7)刺激后,ERK磷酸化水平显著升高(P＜0.05).p-ERK水平在10 min内达到高值,并且随着血管紧张素(1～7)浓度的增加(10-12～10-6mol/L),P-ERK水平逐渐升高.结论:成功构建mas稳定表达细胞模型,并显示出血管紧张素(1～7)受体mas活化可以引起下游ERK1/2信号通路的激活.
关键词： mAs G蛋白偶联受体 血管紧张素(1～7) 组织构建 -
烟酸受体GPR109a及相关激动剂的研究进展
烟酸是临床应用几十年的降血脂药物,近年来研究发现,烟酸作用于G蛋白偶联受体109a(GPR109a)和GPR109b,该受体主要在脂肪细胞和多种免疫细胞中表达.烟酸受体的发现以及对相关不良反应作用机制的研究为寻找活性更强、不良反应较小的降脂药物开启了一条新的途径,为相关心血管疾病及糖尿病并发症的治疗提供了新的思路.本文对以GPR109a为靶标的药物研究成果进行综述.
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G蛋白β、γ亚基对M2受体的磷酸化的影响
目的:探讨G蛋白β、γ亚基在调节G蛋白偶联受体激酶活性的重要作用和G蛋白β、γ亚基影响M2受体磷酸化新的作用机制.方法:利用四个柱层析分离G蛋白α亚基与G蛋白β、γ亚基;将纯化的G蛋白β、γ亚基、GRK-2,[γ-P32]标记的ATP与mAChR2,共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶片干燥后放射性自显影检测M2受体磷酸化结果.结果:G蛋白β、γ亚基在没有激动剂存在的情况下明显增强M2受体的磷酸化.氨甲酰胆碱明显增强M2受体的磷酸化,阿托品或肝素(GRK2抑制剂)完全阻断M2受体的磷酸化.M2受体的磷酸化是依赖激活剂如氨甲酰胆碱作用发生的,这种依赖关系呈明显的剂量关系.结论:G蛋白β、γ亚基是通过上调GRK2活性增强M2受体的磷酸化的.说明Gβγ/同 Go一样均可引起效应蛋白的激活,在细胞信号转导中起同样重要作用,共同介导一系列的生物学效应.
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m5 AChR-G11融合蛋白筛选m5受体配体的研究
目的:以m5AChR-G11融合蛋白为工具,筛选m5受体亚型特异性配体,并且探讨m5AChR-G11融合蛋白中两组分相互作用的机制.方法:采用杆状病毒Sf9细胞表达系统,制备m5AChR-G11融合蛋白;通过[3H]QNB放射配体结合实验和[35S]GTPγS替代结合实验,检测m5AChR-G11融合蛋白的功能.结果:m5AChR-G11融合蛋白的表达水平为(60.39±1.95)pmol·mg-1蛋白.不同配体存在时使融合蛋白中G11与GDP的亲和力发生变化,acetylcholine,McN-A-343,AF-102B,R-(+)-hyoscyamine,tropicamide,alcuronium和atropine存在时以及无配体时,GDP的IC50值分别是134.90,46.77,38.02,10.00,13.80,18.62,5.89,23.40μmol/L.结论:杆状病毒Sf9细胞表达系统表达的m5AChR-G11融合蛋白具备m受体配体结合特性和两组分间的偶联功能.乙酰胆碱是m5受体的完全激动剂,McN-A-343和AF-102B是部分激动剂,R-(+)-hyoscyamine,tropicamide,alcuronium和阿托品是拮抗剂.
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半胱氨酰白三烯受体的研究进展
半胱氨酰白三烯(CysLTs)是一类重要的缩气管物质和炎性介质,包括白三烯C4、D4和E4.细胞膜上一种特异性G蛋白偶联受体介导CysLTs信号的转导,这种受体依据其是否能被抑制剂拮抗而分为两类:CysLT 1类受体(CysLT1)和CysLT 2类受体(CysLT2).CysLT1和CysLT2的基因克隆已经完成,这有利于我们致力于CysLT受体表达调节方面的研究以及探寻CysLTs在病理和生理情况下的新功能.
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H2O2诱导小鼠肌原细胞系C2C12 UⅡ/UT系统的高表达
目的:观察外源给予H2O2对C2C12细胞中UⅡ/UT系统表达的影响.方法:培养小鼠肌原细胞系C2C12细胞株,应用胎盘蓝染色和测定细胞培养液中LDH的含量检测H2O2对细胞损伤的影响,应用放射免疫的方法检测细胞培养液和裂解液中UⅡ的含量,应用RT-PCR法测定C2C12中UT mRNA的表达,应用Western Blot检测不同浓度H2O2对肌原细胞系C2C12中UT蛋白表达的影响.结果:外源给予不同浓度的H2O2,C2C12细胞裂解液中UⅡ的含量各组间无明显差异,但增加了细胞孵育液中UⅡ的含量,10-4M和10-3M时分别增加了83.1％(p＜0.01)和94.5 ％(P＜0.01).低浓度H2O2(0.5× 10-6M, 10-6M,10-5M,10-4 M)刺激明显增加了UT mRNA的表达,而高浓度的H2O2(10-3M)刺激反而使UT mRNA的表达降低.高浓度的H2O2(106M,10-5M,10-4M,10-3M)刺激使UT蛋白表达分别增加了200.1％、255.6％、111.1％和100.1％(均p＜0.05).结论:H2O2作为T2DM发病因素之一的活性氧族,可能是T2DM时骨骼肌组织中UⅡ/UT系统表达增加的一个因素.
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与阿尔兹海默症相关的G蛋白偶联受体研究进展
G蛋白偶联受体(GPCRs)在大脑信号传递中至关重要,而在阿尔兹海默症(AD)中,G蛋白偶联受体通过调控α-、β-及γ-分泌酶分泌、淀粉样前体蛋白(APP)生成及β-淀粉样蛋白(Aβ)降解,直接影响β-淀粉样蛋白在神经系统信号级联反应；另外,阿尔兹海默症中β-淀粉样蛋白的生成可以扰乱G蛋白偶联受体功能.因此,阐明G蛋白偶联受体与阿尔兹海默症发病之间的关联有助于开发以G蛋白偶联受体为靶点的阿尔兹海默症治疗药物.
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GPCRs组成性活性的研究进展及意义
GPCRs是体内大的蛋白质亚家族,其活性涉及体内绝大部分重要的生理和病理进程.研究表明,GPCRs或其突变体能在无配体结合的情况下自发产生部分甚至完全活性程度的生理活性,称之为组成性活性.据此研究者提出了GPCRs激活过程中存在多个中间激活态的观点,从而丰富了配体受体相互作用的经典模型,并使组成性活性突变体(constitutive active mutant,CAM)成为研究GPCRs的新方法.本文系统介绍了组成性活性的研究历程,以及近年来利用CAM的方法研究GPCRs的结构、激活机制和活性调节的历程和进展,和体内组成性活性突变的成因和与疾病的关系,以及CAM在研究药物作用机理和新药研发中的意义.
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与癌症相关的G蛋白偶联受体及通路的研究进展
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一类重要的细胞膜表面跨膜蛋白受体超家族,具有7个跨膜螺旋结构.GPCRs的细胞内信号由G蛋白介导,可将激素、神经递质、药物、趋化因子等多种物理和化学的细胞外刺激穿过细胞膜转导到细胞内不同的效应分子,激活相应的信号级联系统进而影响恶性肿瘤的生长迁移过程.虽然目前药物市场上有很多治疗癌症的小分子药物属于G蛋白受体相关药物,但所作用的靶点集中于少数特定G蛋白偶联受体.因此,新的具有成药性的G蛋白偶联受体的开发具有很大的研究价值和市场潜力.本文主要以在癌症发生、发展中起重要作用的溶血磷脂酸(LPA),G蛋白偶联受体30(GPP30)、内皮素A受体(ETAR)等不同G蛋白偶联受体为分类依据,综述其与相关的信号通路在癌症进程中的作用,并对相应的小分子药物的临床应用和研究进展进行展望.
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G蛋白偶联受体寡聚体结构研究进展
G蛋白偶联受体(GPCR)是细胞膜上大的一类受体,其通过构象变化激活下游G蛋白从而介导细胞响应多种来自内源和外界环境中的信号.自GPCR被发现以来,研究者就一直在努力解析GPCR的构象,x射线晶体衍射技术和GPCR蛋白质结晶技术的发展使得越来越多的GPCR单体在静息状态,以及与不同配体甚至G蛋白结合的晶体结构被成功解析.另一方面,FRET和电子显微技术的运用得到了GPCR二聚化和多聚化的多方面证据.本文将结合近年来该领域的进展,对GPCR寡聚体的结构和构象变化予以系统的综述,这些成果为研究GPCR的功能机制及其特异性的靶点药物开发提供了重要的基础.
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受体活性修饰蛋白研究进展
受体活性修饰蛋白(receptor activity-modifying proteins,RAMPs)属于单跨膜蛋白家族,分三个结构域,RAMP的N端和跨膜区决定本身的功能和受体表型,胞内C端对于配体的信号传导和受体循环有重要作用.目前发现有三个成员:RAMP1、RAMP2和RAMP3.RAMPs通过改变G蛋白偶联受体的糖基化.作用于配体结合区域来调节受体表型.RAMP1与降钙素受体样受体(calcitonin receptor like receptor,CRLR)结合表现出降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)受体表型;RAMP2和RAMP3与CRLR结合则对肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)表现高亲和力,与降钙素受体(calcitonin receptor,CTR)结合则作为胰淀粉样酶(amylin,AMY)受体.由此可见,RAMPs不仅调节受体与配体结合,还影响细胞内的蛋白相互作用调节细胞内信号传导来影响细胞的增殖、迁移、分化等生物学特性.RAMPs还对心血管系统的病理生理有重要调节作用.
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G蛋白偶联受体介导电针干预类风湿关节炎炎性疼痛研究进展
G蛋白偶联受体(GPCRs)在机体内有显著的免疫调节的介导作用。近年来的研究发现,GPCRs在电针干预类风湿关节炎的炎性疼痛效应机制中起着重要作用,其中肾上腺素受体、5-羟色胺受体、腺苷受体、阿片肽受体、多巴胺受体和大麻素受体等诸多受体在中枢神经系统、外周神经系统和炎症局部都分别介导电针对关节炎大鼠炎性疼痛的影响。对电针促进GPCRs表达增加的发生机制的探讨是我们今后研究的方向。
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成人慢性免疫性血小板减少性紫癜患者血小板G蛋白偶联受体的研究
目的:观察成人慢性免疫性血小板减少性紫癜(immune thrombocytopenic purpura,ITP)患者血小板G蛋白偶联受体的变化. 方法:采用流式细胞仪检测ITP患者血小板表达二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)受体(P2Y1、P2Y12)、α2A-肾上腺素能受体(α2A-adrenergic receptor,α2A-AR)和血栓烷 A2受体(thromboxane A2 receptor, TXA2-R)的表达,采用蛋白印迹法检测血小板Gα蛋白、蛋白酶激活受体-1(proteinase-activated receptor 1,PAR-1)和蛋白酶激活受体-4(proteinase-activated receptor 4,PAR-4)的表达.结果:慢性ITP患者血小板表达 P2Y1、P2Y12、α2A-AR和TXA2-R的平均荧光强度分别为 31.4±2.2、29.6±2.1、25.8±2.9 和 39.8±3.1, 明显高于健康对照者 (分别为7.8± 0.8、7.2±1.3、9.8±0.9和4.7±0.6),差异有统计学意义(P<0.01).蛋白印迹法检测显示,慢性ITP患者血小板表达Gα蛋白、PAR-1和PAR-4的累积光密度值分别为 1 046.3±159.96、832.98±98.81 和 1 518.80±272.45,也显著高于健康对照者(分别为 254.49±39.51、203.92±27.47 和 431.27±41.86),差异有统计学意义(P<0.01).结论:成人慢性ITP患者血小板G蛋白偶联受体的表达增多,提示慢性ITP患者的血小板可能通过G蛋白偶联受体的信号转导途径,参与了复杂的生物学过程.
关键词： 慢性免疫性血小板减少性紫癜 血小板 流式细胞仪 G蛋白偶联受体 -
LGR4基因调控小鼠肺组织糖皮质激素受体表达及肺发育
目的:探讨LGR4基因缺失引起新生小鼠死亡的原因及其可能的机制.方法:观察LGR4基因敲除(KO)小鼠出生后48 h内的表现.记录其死亡时间,并对不同基因型小鼠进行生存分析.取LGR4 KO纯合的新生小鼠及不同胚胎期小鼠的肺脏进行病理切片和HE染色,观察其组织形态学改变,并将结果与基因型为野生型(WT)、杂合型的小鼠比较.采用ELISA法检测LGR4 KO纯合小鼠、WT小鼠血清中皮质酮水平,并用蛋白印迹(Western blot)半定量检测小鼠胎肺中糖皮质激素受体(GR)的蛋白水平.结果:LGR4 KO纯合小鼠出生后出现不同程度的呼吸困难、紫绀等表现,52.2%的LGR4 KO纯合小鼠在出生后28 h内死亡.组织学检查发现,LGR4 KO纯合小鼠的肺脏在胚胎晚期和新生期存在明显的结构异常.包括肺泡减少、肺间隔增厚、细胞密度增加.此外,LGR4缺失还引起小鼠胚胎晚期肺中GR水平明显下调,但其对小鼠肾上腺的皮质酮分泌功能并无显著影响.结论:LGR4缺失可引起小鼠肺胚胎晚期发育障碍和新生小鼠肺结构异常,导致小鼠出生后早期死亡,而GR水平的下调可能是其重要机制.
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CD88在肝细胞肝癌组织中的表达及其临床意义
目的:探讨CD88 在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征的关系.方法:应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、免疫组织化学和Western blot检测56 例肝癌及癌旁组织标本中CD88 的表达,比较CD88表达在癌和癌旁组织中的差别,并分析其与临床病理特征的关系.结果:qRT-PCR检测结果显示肝癌组织中CD88 mRNA 的表达明显高于癌旁组织(0.056±0.014比0.003±0.0004,P< 0. 001);癌组织中CD88 mRNA表达在肿瘤直径大于5 cm、有肉眼癌栓和TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期的肝癌患者中明显上调,分别为0.1119±0.0339比0.0256±0.0094、0.0907±0.0271比0.0245±0.009、0.0876±0.02630比0.0253±0.0096(P<0.05);免疫组织化学检测结果显示肝癌CD88阳性率明显高于癌旁组织(55.3%比37.5%,P<0. 05);Western blot检测结果显示肝癌组织中CD88表达高于癌旁组织(3.71±0.92比0.91±0.34,P<0.01).结论:CD88高表达与肿瘤的恶性表型密切相关,它可能在肝癌侵袭和转移过程中发挥重要作用.
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阿尔茨海默病主要相关分子及研究进展
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是常见的老年性疾病,是患病率高的神经系统疾病.AD俗称老年痴呆,由德国医师Alois Alzheimer于1906年首先发现[1],并以其名字命名.
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脂肪酸受体GPR40研究进展
G蛋白偶联受体GPR40是脂肪酸的特异性受体.脂肪酸作为胞外配体,活化GPR40,激活胰岛β细胞内信号转导途径,调节胰岛素分泌,引起胰岛β细胞过度增殖.此外,GPR40还能被噻唑烷二酮类药物活化.GPR40的拮抗剂和(或)激动剂作为新型的抗糖尿病药物研究具有巨大潜力.
