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参芪解毒汤联合P311在肾间质纤维化过程中对α-SMA及α-SMA2 mRNA表达的影响
目的：观察参芪解毒汤联合P311在慢肾衰大鼠肾间质纤维化过程中对α-SMA蛋白表达及α-SMAmRNA的影响，从而明确参芪解毒汤联合P311在慢肾衰肾间质纤维化的过程中的作用，为指导临床提供依据。方法健康雄性SD大鼠60只，除正常对照组外，其余均用UU法制备慢肾衰的动物模型。将大鼠随机分为正常对照组、模型组、模型＋中药组、模型＋P311转染组、模型＋P311转染＋中药组、模型＋P311转染＋科素亚组。利用western blot方法检测各组中α-SMA蛋白的变化；采用实时荧光定量PCR法检测α-SMAmRNA的表达。结果与正常对照组比较，α-SMA各组表达均高于正常对照组且差异有统计学意义（ P﹤0.01）；与模型组比较，用药各组差异均有统计学意义（ P﹤0.01）；与模型＋P311＋中药组比较，模型＋P311＋科素亚组与其差异无统计学意义（ P﹥0.05）。与正常对照组比较，模型组及其他各组α-SMAmRNA差异均有统计学意义（P﹤0.01）；与模型＋中药＋P311组比较，模型＋中药组、模型＋P311组差异均有统计学意义（ P﹤0.01），模型＋科素亚＋P311组与其差异无统计学意义（ P﹥0.05）。结论参芪解毒汤联合P311可减轻肾脏纤维化的程度，延缓慢肾衰大鼠模型肾间质纤维化的过程，这可能与降低α-SMA的蛋白以及α-SMAmRNA的表达有关。
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p311在肺发育及损伤修复中的研究进展
呼吸窘迫综合征是临床危重新生儿尤其是早产儿常见的临床综合征,患儿由于肺泡表面活性物质缺乏而导致肺泡发育障碍,严重时可危及患儿生命.氧疗和辅助通气是改善患儿缺氧状态的重要治疗方法,长时间高氧暴露使未成熟肺的肺泡上皮细胞损伤、坏死,从而导致急性肺损伤,终由于呼吸功能衰竭引起支气管肺发育不良.近年来,支气管肺发育不良在全球发病率逐年递增,存活者常伴有明显的肺功能低下和肺发育不良,目前尚无确定有效的治疗方法. p311基因是一种新发现的功能基因,在人体各器官广泛分布,物种间高度保守,其参与神经、肺及损伤上皮细胞的再生,维持血压平衡,促进肾纤维化及胶质瘤的侵袭等.
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整合素β4结合蛋白与P311在人胚肾293细胞中的表达及共定位
目的:利用激光共聚焦显微镜共定位检测整合素β4结合蛋白与P311蛋白在细胞内的分布,进一步证实它们在细胞内产生相互作用的可能性.方法:实验于2006-03/12在解放军第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.先分别构建能在哺乳动物细胞中表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体,经酶切鉴定正确后,利用脂质体介导法共转染人胚肾293细胞后,激光共聚焦显微镜进行共定位观察.结果:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体经双酶切鉴定正确,转染293细胞后,荧光显微镜下能观察到绿色和红色荧光.激光共聚焦显微镜下观察两者主要分布在293细胞的胞浆和胞核中,并且存在着共定位现象.结论:表达整合素β4结合蛋白的绿色荧光融合蛋白和表达P311的红色荧光融合蛋白的重组载体在空间分布上两者存在相互作用的物质基础.
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人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定
目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.
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荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用
目的 利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用.方法 分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48 h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R).结果 重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3 nm.结论 成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用.
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利用免疫共沉淀验证HT036与P311间的相互作用
目的 利用免疫共沉淀技术验证未知蛋白HT036(hypothetical protein,HT036)和P311间的相互作用.方法 构建能在哺乳动物细胞中表达带HA标签的HT036融合蛋白(HA-HT036)的重组载体pCMV-HA-HT036,经酶切鉴定正确后,和表达带Myc标签的P311融合蛋白(Myc-P311)的重组真核表达载体pCMV-Myc-p311,单独或者共转染人293细胞,利用免疫共沉淀技术验证HT036与P311间的相互作用.结果 构建的重组表达载体pCMV-HA-HT036经双酶切鉴定正确,转染293细胞,抗Myc单克隆抗体沉淀Myc-P311相互作用蛋白复合物后,用抗HA单克隆抗体进行Western blot检测,可以检测到HA-HT036的表达.结论 成功构建了HA-HT036融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中表达后利用免疫共沉淀技术证实HT036与P311之间存在着相互作用.
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以酵母双杂交系统从成人肝cDNA文库中筛选与研究P311相互作用蛋白的基因序列
目的应用酵母双杂交技术研究与增生性瘢痕相关新候选蛋白P311发生相互作用的蛋白.方法应用酵母双杂交系统,以人P311为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,寻找能与之相互作用的阳性克隆.以回复性杂交试验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和生物信息学分析.结果经过酵母双杂交共获得355个克隆,经过测序和验证,终确认8个克隆基因.结论获得的8个基因编码的蛋白可能与P31l的作用过程有关.
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P311和TGF-β1在IgA肾病肾组织中的表达及意义
目的：探讨P311和转化生长因子β1（TGF-β1）在IgA肾病（IgAN）肾组织中的表达及意义。方法应用免疫组织化学方法检测57例IgAN肾组织（IgAN组）和5例正常肾组织（对照组）中P311和TGF-β1的表达情况，同时测定IgAN患者24 h尿蛋白定量、血压、血清肌酐（SCr）、肌酐清除率等，分析P311、TGF-β1表达与不同临床分组、病理分级、有无高血压、蛋白尿程度、SCr水平的关系。结果 IgAN组患者肾组织中P311表达明显高于对照组，且与病理分级呈正相关；小管间质中P311表达与TGF-β1表达、24 h尿蛋白定量等明显相关；SCr>133μumol/L组患者肾组织中P311表达高于SCr<133μmol/L组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论在IgAN 肾组织中P311表达与TGF-β1表达、蛋白尿、肾脏病理分级相关。P311是肾组织纤维化过程中的关键因子，且参与了IgAN疾病进展。
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缺氧诱导因子1α对P311的作用及其对小鼠表皮干细胞迁移的影响
目的 体外条件下模拟缺氧环境,探讨P311和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)相互作用及对小鼠表皮干细胞(ESC)迁移影响. 方法 取15只C57BL/6J野生型新生小鼠,5只同属来源P311基因敲除新生小鼠,分离培养2种小鼠ESC,取第1代细胞行形态学观察,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物CD71、CD49f表达后行以下实验.(1)取2种小鼠ESC划痕处理后,立即按随机数字表法(下同)将P311基因敲除小鼠ESC分为常氧组(将细胞加入完全培养基置于常氧二氧化碳培养箱培养,常氧处理下同)和缺氧组(将细胞置于含体积分数1％氧气的缺氧二氧化碳培养箱培养,缺氧处理下同),每组12个插件;将野生型小鼠ESC分为常氧组、单纯缺氧组、二甲基亚砜(DMSO)对照组(用2 μL DMSO溶剂常氧处理1h后行缺氧培养)、HIF-1α抑制剂组(加入11 μmol/L HIF-1抑制剂2μL常氧培养1h后行缺氧培养)、HIF-1α稳定剂组(加入2μmol/L FG-4592 2 μL常氧处理1h后行缺氧培养),每组12个插件.每组各时相点取3个插件分别于划痕后0(即刻)、12、24、48 h在100倍倒置相差显微镜下测量划痕剩余宽度.(2)取野生型小鼠ESC行缺氧培养,蛋白质印迹法检测缺氧0(即刻)、12、24、48 h HIF-1α蛋白表达.(3)取野生型小鼠ESC同实验(1)分为单纯缺氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制剂组、HIF-1α稳定剂组并行相应处理,分别在缺氧0、12、24、48 h采用实时荧光定量RT-PCR法检测P311 mRNA表达,免疫细胞化学染色法观测P311表达(样本数均为12).(4)取第2代人胚胎肾293(HEK-293)细胞分为空载缺氧组(转染空载质粒后进行缺氧培养)、P311常氧组(转染P311报告基因质粒后进行常氧培养)、P311缺氧组(转染P311报告基因质粒后进行缺氧培养)、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组(HIF-1抑制剂处理后转染P311报告基因质粒然后进行缺氧培养),分别于培养0、12h检测荧光素酶活性,采用生物信息学方法预测HIF-1α对P311转录调节的结合位点并查找P311启动子序列.对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD检验以及Bon-ferroni校正. 结果 (1)ESC结果.细胞呈现铺路石样改变,细胞由于增殖潜能不同而呈现不同克隆状态.CD71-CD49f+细胞占85％左右,说明ESC的干性较强、纯度较高.与P311基因敲除小鼠常氧组比较,单纯缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),缺氧组、野生型小鼠常氧组、DMSO对照组、HIF-1α抑制组、HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05).与野生型小鼠常氧组比较,缺氧组、单纯缺氧组、DMSO对照组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12 h划痕剩余宽度较小(P＜0.05).与单纯缺氧组比较,缺氧组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较大(P值均小于0.05),HIF-1α抑制剂组细胞划痕后12h划痕剩余宽度较大(P＜0.05),HIF-1α稳定剂组细胞划痕后12、24 h划痕剩余宽度较小(P值均小于0.05).7组小鼠细胞间划痕后48 h划痕剩余宽度总体比较差异不明显(F=19.02,P＞0.05).野生型小鼠ESC缺氧0、12、24、48 h的HIF-1α蛋白表达量分别为1.02±0.05、2.56±0.09、1.60±0.17、1.17±0.03.与缺氧0h比较,HIF-1α蛋白表达量缺氧12 h明显增加(P＜0.01),缺氧24 h开始下降但仍高于缺氧0 h(P＜0.05),缺氧48 h后降至常氧水平(P＞0.05).与单纯缺氧组比较,HIF-1 α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311 mRNA表达量均明显下降(P值均小于0.05),HIF-1α稳定剂组细胞P311 mRNA表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).与HIF-1α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞在缺氧0、12、24 h P311mRNA表达量均明显升高(P值均小于0.05).与单纯缺氧组比较,HIF-1α抑制剂组细胞缺氧各时相点P311表达量均明显下降(P值均小于0.05),而HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量则在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).与HIF-1 α抑制剂组比较,DMSO对照组和HIF-1α稳定剂组细胞P311表达量在缺氧12、24 h明显升高(P值均小于0.05).(2)HEK-293细胞结果.培养0h,空载缺氧组、P311常氧组、P311缺氧组、P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(F=13.33,P＞0.05).培养12h,P311缺氧组细胞荧光素酶活性较空载缺氧组高(P＜0.01);P311缺氧组细胞荧光素酶活性较P311常氧组高(P＜0.05);P311缺氧+HIF-1α抑制剂组细胞荧光素酶活性较P311缺氧组低(P＜0.01). 结论 缺氧早期,HIF-1α可能通过诱导P311表达促进小鼠ESC迁移.
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P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞迁移的影响
目的 观察P311在小鼠浅Ⅱ度烧伤及体外细胞创伤模型中对表皮干细胞(ESC)迁移的作用并探讨其机制. 方法 (1)取18只C57BL/6小鼠,其中15只行背部浅Ⅱ度烧伤,于伤后6、12、24、48、72 h取创面及创周皮肤组织,各时相点3只；余下3只小鼠作为正常对照,同法取正常皮肤标本.采用生物素-链霉亲和素-过氧化物酶(SP)染色法观察P311在上述皮肤组织中的表达.(2)取6只新生的C57BL/6小鼠,连续3d腹腔注射50 μg/g溴脱氧尿苷(BrdU,2次/d)建立ESC示踪模型.7周后于其背部制作浅Ⅱ度烧伤创面.伤后72 h取创面皮肤组织制作连续切片,SP法免疫组织化学染色,观察P311阳性和BrdU阳性细胞空间共定位情况.(3)构建腺病毒空载体pAdEasy-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及P311腺病毒表达载体pAdEasy-EGFP-P311,并进行包装.应用Ⅳ型胶原快速黏附法分离培养人ESC,按照随机数字表法将其分为P311高表达组和EGFP对照组,每组3孔,分别以pAdEasy-EGFP-P311及pAdEasy-EGFP腺病毒感染ESC.2组ESC经丝裂霉素C处理2h后行划痕实验.划痕后0(即刻)、24、48、72 h测量固定范围内划痕剩余面积,计算划痕愈合面积百分比.对数据进行独立样本t检验. 结果 (1)浅Ⅱ度烧伤后不同时相点,P311在创面不同部位的表达量各不相同.伤后创面毛囊、新生表皮中P311表达量随时间延长逐渐上升；创周表皮及毛囊的P311表达量于伤后12 h达高峰,72 h回落至正常.(2)应用BrdU标记的小鼠浅Ⅱ度烧伤创面新生表皮层可见P311阳性细胞和BrdU阳性细胞共定位.(3)划痕后48、72 h,P311高表达组ESC划痕愈合面积百分比分别为(69±31)％、(89±26)％,明显高于EGFP对照组[(35 ±12)％、(46±31)％,t值分别为-2.336、-2.611,P值均小于0.05]. 结论 P311可明显促进小鼠浅Ⅱ度烧伤创面及体外细胞创伤模型中的ESC迁移,可能在创面修复中起重要作用.
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增生性瘢痕成纤维细胞中羟基丙酮酸异构酶同系物结合结构域分析
目的 了解增生性瘢痕Fb中羟基丙酮酸异构酶同系物(HYI)与P311蛋白相互作用的结合区域. 方法(1)以克隆有P311的pMD18-T质粒为模板,对P311进行PCR扩增；Trizol法提取人增生性瘢痕Fb的总RNA,对HYI进行RT-PCR扩增,采用双酶切法分别构建pGA DT7-P311和pGBKT7-HYI重组载体,PCR及测序验证.采用Prot Seale软件和HNN软件对HYI蛋白进行二级结构分析,据此结果扩增HYI-1(1 ～447 bp)、HYI-2(247 ～447 bp)、HYI-3(1 ～279 bp)、HYI-4(247 ～654 bp)片段,双酶切法构建pGBKT7-HYI-1、2、3、4重组载体,经PCR及测序验证.(2)采用醋酸锂法将酵母细胞AH109制备成感受态细胞,粗略等量分为HYI全长与HYI-1、2、3、4杂交组,以及阳性对照组和阴性对照组.采用聚乙二醇-醋酸锂法,前5组分别同时转化pGBKT7-HyI全长、各片段的重组载体与pGADT7-P311重组载体,后2组分别同时转化pGBKT7-53与pGADT7-RecT重组载体、pGBKT7-Lam与pGADT7-RecT重组载体.转化后即刻,取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤及组氨酸的培养基(简称四缺培养基)上,另取各组部分细胞分别涂布在缺乏亮氨酸和色氨酸的培养基(简称二缺培养基)上,培养3～6d,观察菌株生长情况,5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷显色反应检测菌落β半乳糖苷酶表达. 结果(1)克隆出的P311片段与Genbank中P311(序号hsu36189)序列一致.与Genbank中HYI(序号AY775560)序列对比,HYI基因扩增片段在496 bp处的A替换为了G.经验证各重组载体插入片段无误.(2)计算机模拟结果显示,组成HYI蛋白的216个氨基酸中,可能形成α螺旋的氨基酸有101个,可能形成无规则卷曲的氨基酸有90个,可能形成延伸链的氨基酸有25个.(3)HYI-1、2、3、4克隆片段大小与预期相符,经验证各重组载体插入片段无误.(4)除阴性对照组菌株未见在四缺培养基上生长外,其他组菌株均在2种培养基上生长,其中HYI-2(α螺旋结构少)、HYI-3杂交组长出菌落较少.(5)除生长在二缺培养基上的阴性对照组菌落和生长在四缺培养基上的HYI-2杂交组菌落未见β半乳糖苷酶表达外,其他在四缺培养基上长出的各组菌落均有β半乳糖苷酶表达. 结论 HYI与P311蛋白可能以α螺旋结构紧密结合,在增生性瘢痕Fb向肌成纤维细胞转分化过程中发挥重要作用.
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P311和转化生长因子β1相互作用及其对小鼠成纤维细胞功能的影响
目的 探讨P311和TGF-β1在小鼠皮肤Fb中的相互作用及其对Fb功能的影响.方法 取P311野生型和P311基因敲除型C57BL/6新生小鼠各5只,分离培养2种小鼠皮肤Fb.采用第2代Fb完成以下实验,每个实验重复3次.(1)取P311野生型小鼠Fb,按随机数字表法(分组方法下同)分为空白对照组和P311过表达组,每组36孔.空白对照组每孔加入10 μL空载体腺病毒,P311过表达组每孔加入等效价P311腺病毒表达载体.培养48 h后,采用实时荧光定量RT-PCR法和蛋白质印迹法分别检测2组Fb的P311 mRNA及TGF-β1、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量(检测方法下同).(2)取P311野生型和P311基因敲除型小鼠Fb各4瓶,待细胞生长至80％ ～90％融合时,检测2种Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.(3)取P311野生型小鼠Fb用体积分数为1％ FBS的DMEM培养液饥饿处理3h后,分为空白对照组及5、10、15、20、25 ng/mL TGF-β1组,每组2瓶.空白对照组常规培养,后5组Fb分别加入5、10、15、20、25 ng/mL TGF-β1溶液,培养48 h后检测6组Fb的P311 mRNA表达量.另取P311野生型小鼠Fb,分为空白对照组和10 ng/mL TGF-β1组,每组6孔,免疫荧光法检测2组Fb的P311蛋白表达情况.(4)将P311野生型小鼠Fb同前饥饿处理后,分为空白对照组和10 ng/mL TGF-β1组,每组2瓶,空白对照组常规培养,后组加入10 ng/mL的TGF-β1溶液,培养48 h后,检测2组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.取P311基因敲除型小鼠Fb,同前分组及处理后,检测2组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量.对数据行单因素方差分析、t检验. 结果 (1)P311过表达组Fb的P311 mRNA表达水平较空白对照组增高近30万倍(t=9.942,P＜0.001).P311过表达组Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA,以及TGF-β1前体、TGF-β1活化态、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量均较空白对照组明显升高(t值为8.192～49.090,P值均小于0.01).(2) P311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低(t值为8.157 ～22.270,P值均小于0.01).P311基因敲除型小鼠Fb的TGF-β1前体、α-SMA、Ⅰ型胶原的蛋白表达量较P311野生型小鼠Fb明显降低(t值为2.995 ～12.600,P＜0.05或P＜0.01),2种Fb的TGF-β1活化态蛋白表达量相近(t=1.070,P＞0.05).(3)空白对照组及5、10、15、20、25 ng/mLTGF-β1组Fb的P311 mRNA表达量分别为1.28±0.44、3.61±0.91、6.64±0.92、6.58±1.04、1.79±0.31、0.16±0.06.与空白对照组Fb的P311 mRNA表达量比较,5、20 ng/mL TGF-β1组无明显变化(t值分别为2.302、0.955,P值均大于0.05),10、15 ng/mL TGF-β1组明显增高(t值分别为5.630、4.710,P值均小于0.001),25 ng/mL TGF-β1组明显降低(t=2.509,P＜0.01).10 ng/mL TGF-β1组Fb的P311蛋白表达明显强于空白对照组.(4) P311野生型小鼠10 ng/mL TGF-β1组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高(t值为3.523～14.290,P ＜0.05或P＜0.01).P311基因敲除型小鼠10 ng/mL TGF-β1组Fb的α-SMA、Ⅰ型胶原的mRNA和蛋白表达量均较空白对照组有不同程度的升高(t值为4.895～ 14.870,P＜0.05或P＜0.01).结论 P311和TGF-β1在小鼠皮肤Fb中存在相互作用,可共同促进Fb的分化.
