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左金方及其主要成分小檗碱对人胃癌细胞SGC7901上皮间质转化的影响
目的:研究左金方及其主要成分小檗碱对人胃癌细胞SGC7901上皮间质转化的影响.方法:制备左金方冻干粉,采用高效液相色谱法(HPLC),对比小檗碱对照品,明确左金方冻干粉的纯度和小檗碱含量;采用噻唑蓝(MTT)比色法检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞生长影响,并确定后续实验给药浓度;划痕实验检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞迁移能力的影响;细胞侵袭实验(transwell小室)检测左金方及小檗碱对SGC7901细胞侵袭能力的影响;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测左金方及小檗碱作用SGC7901细胞24 h后对上皮间质转化(EMT)标志性蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin),神经型钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达的影响.结果:制备的左金方冻干粉含9.85％的小檗碱;左金方、小檗碱对 SGC7901细胞作用24 h的半数抑制浓度(IC50)分别为165,51.8 mg·L-1,选用165 mg·L -1左金方(含小檗碱16.3 mg·L-1)与16.3 mg·L-1小檗碱进行后续实验;左金方及小檗碱均能抑制SGC7901细胞划痕愈合及侵袭能力;Western blot结果显示,与空白组比较,左金方及小檗碱能明显上调E-cadherin表达,下调N-cadherin表达(P＜0.05).结论:左金方及其主要成分小檗碱能抑制人胃癌细胞SGC7901的生长、侵袭及迁移,能抑制SGC7901细胞上皮间质转化,且小檗碱在复方中为其主要药效成分.
关键词： 左金方 小檗碱 胃癌SGC7901 上皮间质转化(EMT) 转移 -
左金方联合5-FU抑制人胃癌细胞RF-48的增殖作用研究
目的:研究左金方联合5-FU抑制胃癌RF-48细胞增殖,探讨其协同增效作用.方法:Cell Counting Kit-8检测细胞增殖率的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化.结果:左金方对HFE145细胞活力的影响很小,而小剂量的5-FU会引起较大的细胞毒性,不同浓度左金方、5-FU均能诱导RF-48细胞的凋亡;左金方联合5-FU后对HFE145细胞存活率的影响,以及对RF-48细凋亡率的影响,与单独用药组比较差异有统计学意义,Hochest染色RF-48细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征.结论:左金方与5-FU联合用药大幅降低了5-FU的细胞毒性作用,显著提高了HFE145细胞的存活率,促进了人胃癌细胞RF-48的凋亡,比左金方或者5-FU单独用药对胃癌的治疗效果更好.
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左金方和5-FU对胃癌细胞生长及BAX/Bcl-2表达的调控研究
目的:研究左金方和5-FU单独与联合对人正常胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌MGC803细胞生长及凋亡的影响及对BAX/Bel-2蛋白表达水平的改变.方法:将不同浓度的左金方、5-FU及两药联合作用于体外培养的人胃黏膜上皮细胞GES-1和人胃癌细胞MGC803,Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测细胞增殖率的变化,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测bel-2、bax蛋白表达.结果:1.00 ug·mL-1左金方、50.00、100.00 ug· mL-1 5-FU作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(107.54±2.25)％、(53.67±1.91)％和(47.43±1.35)％,作用MGC803细胞24 h后,细胞凋亡率分别为(45.46±1.66)％、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)％;左金方联合5-FU (1.00+50.00)、左金方联合5-FU (1.00 +100.00)作用GES-1细胞24 h后,细胞存活率分别为(81.66±2.22)％和(78.68±2.10)％,作用MGC803细胞24 h后,相应的凋亡率为(61.30±1.71)％和(71.30±1.79)％,与单独用药比较差异有统计学意义.Western Blot凝胶电泳图可以看出,左金方联合5-FU (1.00+50.00)、左金方联合5-FU(1.00+ 100.00)作用MGC803细胞24 h后,进一步促进Bax的表达,降低Bel-2的表达,与各单独用药组比较差异有统计学意义.结论:左金方与5-FU联合用药有大幅降低5-FU细胞毒性作用,显著提高人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的存活率;通过促进MGC803细胞中Bax蛋白的高表达和Bel-2的低表达,促进人胃癌细胞的凋亡.
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左金方体内外抑制幽门螺杆菌的实验研究
目的:探讨左金方在体内外抑制幽门螺杆菌(hlicobacter pylori,Hp)生长繁殖的作用.方法:采用琼脂稀释法测定左金方和克拉霉素对Hp小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC).60只BALB/c小鼠雌雄各半,按体质量分层随机分为正常组、模型组、胃三联组(0.351 mg·g 1)及左金方低、中、高剂量组(0.364,0.728,1.456 g·kg-1·d-1)6组,采用抗生素加Hp的方法连续灌胃7d建立Hp感染动物模型.从第11天开始连续灌胃给药8周后处死小鼠,进行血清尿素酶抗体检测以及病理切片检查.结果:琼脂稀释法测得左金方小MIC值为200 μg· mL-1,克拉霉素小MIC值为0.5 μg· mL-1.血清幽门螺杆菌抗体检测、小鼠胃黏膜病理切片结果均提示Hp感染动物模型复制成功,与正常对照组比较差异有统计学意义.胃三联组、左金方高、中、低剂量组均能有效抑制体内Hp的生长,与模型对照组比较差异有统计学意义.结论:左金方在体内体外均能有效地抑制幽门螺杆菌的生长.
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左金方治疗幽门螺杆菌感染相关性胃病临床观察
目的:观察左金方治疗幽门螺杆菌感染相关性胃病的临床疗效.方法:采用随机数字表法将幽门螺杆菌感染相关性胃病患者90例分为两组各45例,对照组予以标准三联方案(奥美拉唑+阿莫西林+克拉霉素)治疗,治疗组采用左金方+奥美拉唑治疗,比较两组患者中医症状评分、幽门螺杆菌根除率及不良反应发生率.结果:治疗组患者中医症状评分均较治疗前显著降低(P＜0.05),与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);14C呼气试验显示,治疗组、对照组患者幽门螺杆菌根除率分别为73.33％、80.00％,组间差异无统计学意义(P＞0.05);治疗组不良反应发生率(6.67％)较对照组(26.67％)显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:左金方具有根除幽门螺杆菌效果,与标准三联治疗效果相当,并可有效改善患者中医症状评分,降低不良反应发生率.
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星点设计-响应面法优化左金方提取工艺
目的:采用星点设计-响应面法优化左金方的提取工艺.方法:选取对提取工艺影响较大的乙醇浓度、溶媒比、提取时间为考察因素,以盐酸小檗碱、盐酸巴马汀含量为考察指标,对其进行综合评定,优选佳提取工艺条件.结果:佳提取工艺为8.25倍量70.57％乙醇提取3次,每次90.71 min,按优化后处方提取的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀的含量较高.结论:星点设计-响应面法优化左金方的提取工艺,方法简便,预测性良好.
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左金方与黄连中小檗碱型生物碱提取动力学差异性的研究
目的:利用已建立的中药提取动力学数学模型研究单复方中药成分溶出差异规律.方法:运用中药复方成分提取动力学数学模型研究黄连及左金方中小檗碱类生物碱的提取动力学行为;运用HPLC指纹图谱法同时测定黄连或复方中小檗碱类生物碱的含量及ρ2、W0参数,运用吸水法测定V0、V1、V2参数;并用SPSS软件非线性拟合各成分提取动力学的M、α、N、β、L参数,用EXCEL依公式计算各成分K、k1'、k2'、ρ1、ρ2、tmax、cmax、AUC、P、D参数及偏差.结果:黄连的V0、V1、V2分别为47.02、6.75、446.23 mL;盐酸小檗碱、盐酸蛇根碱、盐酸巴马亭的ρ2分为0.720 8、0.564 7、0.625 7;ω0分别为7.561%、1.220%、1.450%;单味黄连及左金方中盐酸小檗碱、盐酸蛇根碱、盐酸巴马亭药时曲线呈三室模型(R2＞0.95),主要提取动力学参数tmax分别为251.6、249.3、343.9、172.8、287.63、175.4 min;cmax分别为4.958、0.7382、1.217、4.252、0.6055、0.9185 mg/mL;P分别为65.02%、60.00%、83.25%;55.77%、49.22%、62.81%;D分别为0.043 04%、0.052 62%、0.017 13%、0.018 25%、0.003 024%、0.012 89%.单味黄连与左金方提取动力学参数偏差以盐酸蛇根碱的AUC大,为-1613%,以盐酸蛇根碱k1'小,为-12.40%.k1'、k2'、ρ1均为负数,说明复方配伍溶出效果差于单味黄连,cmax、P、D均为正数,说明单味黄连溶出效果优于左金方配伍.其偏差值越大,效果越明显.结论:中药提取动力学数学模型能客观地描述中药及复方中有效成分的提取行为,能定量表达其溶出差异,是研究中药复方溶解规律和提取工艺的有效工具.
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左金方与反左金方抗MPP+诱导SH-SY5Y细胞凋亡作用的对比研究
目的 研究左金方和反左金方水提物对四氢吡啶离子(MPP+)诱导SH-SY5Y细胞凋亡的影响.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,建立Mpp+致SH-SY5Y细胞凋亡的模型,同时给予左金方和反左金方水提物干预.应用MTT比色法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hochest染色观察凋亡细胞形态学的改变.结果 0.5 mmol·L-1MPP+作用于SH-SY5Y细胞60 h可诱导细胞凋亡,细胞存活率降低至(50.87±2.31)％,凋亡率增加至(43.38±1.49)％,Hochest 33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光.左金方和反左金方水提物与0.5 mmol·L-1MPP+同时处理SH-SY5Y细胞后,能够明显改变细胞的凋亡学特性,当药物浓度增加到2.0 mg·mL-1时,细胞存活率分别升高至(63.16±1.89)％和(75.19±1.97)％,与模型组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);其凋亡率由模型组的(43.38±1.49)％分别降低到(20.17±1.43)％和(9.41±1.27)％(P＜0.01),反左金方(热性)抗凋亡的作用更强.结论 左金方(寒性)和反左金方(热性)均能对抗由MPP+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,而反左金方(热性)抗凋亡作用更强,中药药性不同,其抗凋亡作用亦不同.
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左金方及其组方成分对人胃癌细胞SGC-7901凋亡及膜电位的影响
目的 比较左金方及其组方成分(黄连、吴茱萸及巴马汀、小檗碱、药根碱、吴茱萸碱、吴茱萸次碱)对人胃癌细胞SGC-7901生长的活性抑制、凋亡诱导和膜电位的影响.方法 采用MTT比色法观察受试药物对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;以及JC-1试剂盒测定细胞膜电位.结果 左金方、黄连、巴马汀和小檗碱分别作用SGC-7901细胞后,均能抑制细胞活性,且呈时间依赖性;1.0mg·mL-1左金方和对应浓度的黄连(0.857 mg·mL-1)、巴马汀(9.19 μg·mL-1)、小檗碱(39.85 μg·mL-1)作用于SGC-7901细胞48 h,细胞凋亡率分别为(36.40±1.59)％,(21.90±0.27)％,(9.32±2.58)％和(13.89±3.56)％,与对照组(1.69±1.91)％比较差异均有统计学意义(P＜0.01),左金方与黄连、巴马汀、小檗碱组间比较差异亦具有统计学意义(P＜0.01).对应浓度的吴茱萸(0.143mg·mL-1)、药根碱(4.86 μg·mL-1)、吴茱萸碱(0.17 μg·mL-1)与吴茱萸次碱(0.19 μg·mL-1)几乎无作用.JC-1染色检测结果显示,左金方及相应浓度的黄连、巴马汀和小檗碱作用SGC-7901细胞4h后,可以明显引起细胞线粒体膜电位的下降,实验结果与凋亡检测结果相一致.结论 左金方、黄连、巴马汀和小檗碱均能通过降低细胞线粒体膜电位,诱导胃癌细胞的凋亡,且左金方的作用优于黄连、小檗碱和巴马汀,但吴茱萸及其有效成分几乎无作用.
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左金方通过上调Bax/Bcl-2下调MMP诱导人胃癌细胞SGC-7901的凋亡
目的 研究左金方诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用机制.方法 采用MTT比色法观察左金方对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化;Western blot方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达以及JC-1试剂盒测定细胞膜电位.结果 左金方能抑制细胞活性,与时间-剂量呈依赖关系.0.1、0.5和1.0 mg·mL-1左金方作用于SGC-7901细胞48 h后,细胞凋亡率分别为(11.60±1.24)％、(21.80±0.28)％、(36.40±1.59)％,与对照组(2.66±1.33)％比较差异均有统计学意义(P＜0.01);Hochest染色细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征;左金方可降低SGC-7901细胞Bcl-2基因表达和增加Bax基因表达;左金方作用SGC-7901 4 h后,可以明显引起细胞MMP的下降;1.0 mg·mL-1左金方组的作用尤其明显.结论 左金方通过上调Bax/Bcl-2比率,下调MMP诱导了人胃癌细胞SGC-7901的凋亡.
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左金方提取工艺研究
目的:优选左金方水提工艺.方法:采用L9(34)表设计水提正交实验,水提工艺以提取时间、加水量、提取次数为考察因素,以盐酸小檗碱含量及得膏率作为评价指标.结果:佳水提工艺为8倍水提取2小时,提取3次.结论:该水提工艺简单可行,重复性良好,为左金方的工业化生产提供实验依据.
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左金方、黄连、吴茱萸诱导人胃癌细胞SGC-7901凋亡的作用比较
目的:比较左金方、黄连、吴茱萸对人胃癌细胞SGC-7901生长的活性抑制和凋亡诱导作用.方法:采用MTT比色法观察左金方、黄连、吴茱萸对SGC-7901的生长抑制情况;流式细胞仪PI单染亚二倍体峰分析细胞凋亡率;Hoechst 33258染色观察细胞形态学变化以及Western blot方法检测左金方、黄连、吴茱萸对人胃癌细胞SGC-7901中Bcl-2、Bax蛋白表达的影响.结果:左金方和黄连分别作用SGC-7901细胞后,均能抑制细胞活性,且与时间呈依赖关系;1.0 mg·mL-1左金方和对应浓度的黄连(0.857 mg·mL-1)作用于SGC-7901细胞48 h,细胞凋亡率分别为(36.40±1.59)％和(21.90±0.27)％,与对照组(1.69±1.91)％比较差异均有统计学意义(P＜0.01),组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01),对应浓度的吴茱萸(0.143mg·mL-1)几无作用;Hochest染色细胞出现核固缩状和颗粒状荧光等典型的凋亡学特征;左金方和黄连均可降低SGC-7901细胞Bcl-2基因表达和增加Bax基因表达.结论:左金方与黄连均可通过上调Bax/Bcl-2的比率诱导胃癌细胞的凋亡,但左金方的作用优于黄连(P＜0.01),吴茱萸几无作用.
