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岩大戟内酯B对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响
目的:探讨岩大戟内酯B (jolkinolide B,JB)对人乳腺癌MDA-M B-231细胞增殖及生长周期的影响.方法:取对数生长期的MDA-MB-231细胞,加入JB,使终质量浓度分别为0,2.5,5,10,20,40,80 mg·L-1,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测岩大戟内酯B对MDA-MB-231细胞的生长抑制率.另设10,20,40,80 mg·L-1组的JB,采用流式检测技术分析岩大戟内酯B对MDA-MB-231细胞的细胞周期,RT-PCR及Western blot检测真核细胞翻译起始因子(eIF4E),细胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因mRNA表达及蛋白水平.结果:随着岩大戟内酯B浓度增加可显著抑制MDA-MB-231细胞的增殖,G1期细胞阻滞.与空白组比较,20,40 μmol·L-的岩大戟内酯B可抑制CyclinD1和eIF4E的mRNA表达,转染eIF4E-siRNA组CyclinD1的mRNA表达及蛋白水平也被抑制,同时细胞周期阻滞在G1期(P ＜0.05,P＜0.01).结论:岩大戟内酯B可通过下调eIF4E及CyclinD1的表达而阻滞细胞周期于G1期.
关键词： 岩大戟内酯B 真核细胞翻译起始因子 细胞周期 -
岩大戟内酯B刺激MCF-7细胞条件培养基降低人脐静脉血管内皮细胞的增殖和迁移
目的:观察岩大戟内酯B(jolkinolide B,JB)刺激MCF-7条件培养基对人脐静脉血管内皮细胞的影响,并分析岩大戟内酯B的作用机制.方法:分别用25,55,85 mg·L-1岩大戟内酯B刺激MCF-7人乳腺癌细胞为JB刺激组,正常培养的MCF-7细胞为MCF-7组.获得25,55,85 mg·L-1 JB刺激的MCF-7细胞上清液为相应浓度的条件培养基.利用各组条件培养基分别培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)为25,55,85 mg·L-1 JB组,正常培养的HUVEC为非条件培养基组.分别用噻唑蓝(MTT)比色法,Annexin V-FITC细胞凋亡实验,细胞划痕实验和transwell细胞小室迁移实验观察25,55,85 mg·L-1 JB组HUVEC增殖、凋亡、迁移的变化;并利用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测JB对MCF-7细胞的作用机制,酶联免疫吸附试验(ELISA)分析各组条件培养基中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量变化.结果:与正常组比较,25,55,85 mg·L-1 JB组HUVEC细胞凋亡数目逐渐升高(P＜0.01),HUVEC增殖显著降低(P ＜0.01);25,55,85 mg·L-1 JB组HUVEC细胞划痕面积闭合率和细胞迁移率较非条件培养基组均显著降低(P＜0.01).与MCF-7比较,25,55,85 mg·L-1 JB均能够明显抑制MSC-7细胞蛋白激酶B/信号传导及转录激活因子3/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Akt/STAT3/mTOR)信号通路表达,下调MCF-7细胞表达的VEGF因子.结论:岩大戟内酯B通过抑制Akt/STAT3/mTOR信号通路下调MCF-7细胞旁分泌VEGF,抑制血管内皮细胞的增殖或迁移活性.
关键词： 岩大戟内酯B MCF-7乳腺癌细胞 人脐静脉血管内皮细胞 增殖 迁移 Akt信号通路 -
不同炮制方法对蒙古族药狼毒毒效的影响
目的:探讨蒙古族药狼毒炮制减毒药性理论的科学性,了解其炮制前后药效变化,并建立各样品中岩大戟内酯B和狼毒乙素含量测定的RP-HPLC.方法:采用HPLC-Q-TOF/MS技术比较蒙古族药狼毒炮制前后的成分差异;通过正常小鼠的急性毒性作用及泻下作用比较炮制对该药材毒性和药效的影响,利用RP-HPLC测定蒙古族药狼毒及其炮制品中岩大戟内酯B和狼毒乙素的含量,流动相乙腈(A)-0.1％冰乙酸水溶液(B)梯度洗脱(0 ～5 min,40％A;5～ 10 min,40％ ～ 50％A;10～30 min,50％ ～ 55％A;30 ～ 40 min,55％ ～60％ A;40 ～45 min,60％ ～ 70％ A),检测波长250 nm,柱温30℃.结果:与生品相比,蒙古族药狼毒在炮制后奶制品、诃子汤制品、酒制品中分别有30,20,21个峰的含量降低.狼毒生品及奶、酒、诃子汤制品粉末的半数致死量分别为2.694,3.642,3.461,4.309 g·kg-1.药效试验表明药物粉末给药剂量为0.53,0.133 g·kg-1时,狼毒生品及其各炮制品均能明显提高小鼠小肠墨汁推进率.狼毒中狼毒乙素和岩大戟内酯B的线性范围分别为0.060 12 ～1.202 4,0.060 72 ～1.214 4μg,平均加样回收率分别为107.55％ (RSD 4.7％)和103.03％ (RSD 3.6％).结论:蒙古族药狼毒不同方法炮制后其化学成分含量会不同程度降低,进而可能会降低部分刺激性成分含量或使其转化为毒性较小成分,从而降低了其毒性.蒙古族药狼毒炮制后的粉末较未经炮制的粉末毒性降低,炮制后对该药材的泻下作用无影响,即炮制可减毒保效.狼毒炮制机制可能与炮制后化学成分含量变化有关.建立的HPLC准确可靠、重复性好,可用于蒙古族药狼毒及其炮制品中岩大戟内B和狼毒乙素的含量测定.
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岩大戟内酯B对裸鼠移植MCF-7乳腺癌抗肿瘤作用实验研究
目的 探讨岩大戟内酯B 对裸鼠移植MCF-7 乳腺癌细胞生长抑制作用及其机理.方法 雌性BALB/c 裸鼠12只,接种MCF-7 移植成瘤后分4 组,分别为空白对照组;岩大戟内酯B 组;5-Fu 组;岩大戟内酯B+5-Fu 组.每3 天腹腔给药1次,持续4 周,剥离瘤组织,通过计算肿瘤组织体积观察药物抗肿瘤作用;采用免疫组化观察药物对PI3K/Akt mTOR 信号通路的影响.结果 各组根据肿瘤生长曲线分析,5-Fu 组、岩大戟内酯B 组、岩大戟内酯B+5-Fu 组与空白对照组比较,有统计学差异(p<0.05);免疫组化结果 显示加药处理组与空白对照组比较,p-PK3K、p-AKT 蛋白表达降低,mTOR 蛋白表达增高(p<0.05).结论 岩大戟内酯B 对裸鼠MCF-7 移植瘤的肿瘤组织生长明显抑制作用,并可能与抑制PI3K/Akt mTOR 信号通路有关.
关键词： 岩大戟内酯B MCF-7 PI3K/Akt mTOR -
岩大戟内酯B对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响
目的:探讨岩大戟内酯B(jolkinolide B)诱导人乳腺癌Bcap37细胞凋亡及其可能机制.方法:分别应用MTT和AnnexinV-FITC/PI双染法检测jolkinolide B对Bcap37细胞的生长抑制率和细胞凋亡率；用流式细胞仪检测线粒体膜电位和细胞内游离Ca2+浓度的变化；RT-PCR检测jolkinolide B对Bcap37细胞caspase-3mRNA表达的影响.结果:jolkinolide B可显著抑制Bcap37细胞的增殖,呈剂量和时间效应关系；随jolkinolide B剂量增加,细胞凋亡率明显增加；线粒体膜电位下降,并伴有细胞内游离钙浓度增加,与对照组相比差异显著(P＜0.01),同时caspase-3mRNA表达水平明显增高.结论:jolkinolide B可通过提高细胞游离Ca2+水平,激活内源性线粒体信号转导途径而诱导Bcap37细胞凋亡.
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细胞自噬对岩大戟内酯B诱导的白血病细胞HL-60凋亡的影响
目的 探讨自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)和自噬激动剂雷帕霉素(RAPA)对岩大戟内酯B诱导的人白血病细胞系HL-60细胞凋亡的影响.方法 采用Western blot分析检测不同浓度的岩大戟内酯B作用不同时间后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和自噬调节因子Beclin-1等的表达;将HL-60细胞分为空白对照组、岩大戟内酯B组、岩大戟内酯B联合5 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 mmol/L 3-MA组、岩大戟内酯B联合10 nmol/LRAPA组和岩大戟内酯B联合20 nmol/L RAPA组.采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测人白血病细胞系HL-60细胞的凋亡情况;检测Caspase-3蛋白酶的活性.结果 岩大戟内酯B能够诱导白血病细胞HL-60自噬,增加LC3-Ⅱ和自噬调节因子Beclin-1的表达(P＜ 0.05);3-MA可降低岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡和Caspase-3的活性(P＜0.05),而RAPA则提高了岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡率及Caspase-3的活性(P＜0.05).结论 岩大戟内酯B可诱导HL-60细胞自噬,细胞自噬在岩大戟内酯B诱导的HL-60细胞凋亡中起到了非常重要的作用.
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JAK2/STAT3信号转导通路在岩大戟内酯B诱导的前列腺癌细胞PC-3凋亡中的作用
目的 探讨岩大戟内酯B诱导的人前列腺癌细胞系PC-3细胞凋亡以及JAK2/STAT3信号转导通路在此过程中的作用.方法 不同浓度的岩大戟内酯B处理人前列腺癌细胞系PC-3细胞0、24、48、72 h后,采用台盼蓝染色法检测PC-3细胞存活率;采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染流式细胞仪检测PC-3细胞凋亡率;West-ern blot分析检测岩大戟内酯B作用不同时间后JAK2/STAT3信号转导通路的表达;预先用不同浓度的JSI-124(选择性STAT3途径抑制剂)处理PC-3细胞60 min,观察岩大戟内酯B作用不同时间后PC-3细胞的凋亡情况.结果 岩大戟内酯B能够诱导前列腺癌细胞PC-3凋亡,降低磷酸化-JAK2/STAT3的表达,JSI-124可以提高岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡率.结论 JAK2/STAT3信号转导通路参与了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡过程.JSI-124通过特异性地抑制STAT3活性提高了岩大戟内酯B诱导的PC-3细胞凋亡率.
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JNK通路参与17羟岩大戟内酯B诱导的U251细胞凋亡
目的：探讨c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路在17羟岩大戟内酯B（HJB）诱导人脑胶质瘤细胞U251细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养U251细胞24 h，分为5组，分别用MTT法检测细胞活性、流式细胞仪检测细胞凋亡率、分光光度法检测Caspase-3和Caspase-9的相对活性、Western Blot法检测JNK和p-JNK的蛋白表达。结果与空白对照组相比，单独应用HJB可使U251细胞活性减弱，早期凋亡率明显升高，Caspase-3及Caspase-9的相对活性升高（ P＜0．05）；与单独应用HJB组相比，应用HJB和SP600125可使U251细胞活性升高，细胞早期凋亡率明显下降，Caspase-3及Caspase-9的相对活性下降（ P＜0．05）。 Western Blot结果显示HJB可使p-JNK蛋白表达明显增强，经SP600125预处理后，p-JNK蛋白表达明显减弱（P＜0．05）；JNK蛋白表达没有变化（P＞0．05）。结论 HJB可抑制U251细胞增殖和诱导细胞凋亡；JNK信号途径活化介导了HJB诱导的凋亡；JNK途径的活化导致了下游caspase途径的活化。
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UPLC法同时测定狼毒大戟中岩大戟内酯A和B
目的 建立UPLC法同时测定狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.中岩大戟内酯A和B的含有量.方法 狼毒大戟甲醇提取物的分析采用Waters BEH C18色谱柱(2.1 mm×50mm,1.7 μm);流动相乙腈-水,梯度洗脱;体积流量0.4 mL/min;检测波长250 nm;柱温35 ℃.结果 岩大戟内酯A和B分别在1.804 ～54.12 μg/mL(r=0.999 5)和9.663 ～ 209.8 μg/mL(r=0.999 8)范围内线性关系良好,平均加样回收率分别为98.3％、98.6％,RSD分别为0.76％、0.77％.结论 该方简便准确,重复性好,可用于狼毒大戟的质量控制.
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岩大戟内酯B对人卵巢癌Skov3细胞的增殖抑制作用
目的 探讨岩大戟内酯B(JB)对人卵巢癌Skov3细胞的增殖抑制作用及可能机制.方法 采用不同浓度的JB处理卵巢癌Skov3细胞48 h,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Skov3细胞的增殖抑制率,Hoechst法检测Skov3细胞凋亡指数,Western blot检测Akt、P-Akt(Ser473)、Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白水平.结果 0.1,1.0,5.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的JB可呈剂量依赖的方式抑制Skov3细胞的增殖,IC50为5.28μmol/L;20.0 μmol/L JB和30.0 μmol/L LY294002(PI3K抑制剂)均可增加Skov3细胞凋亡指数,降低P-Akt(Ser473)/Akt水平,增加促凋亡基因(Bax、Caspase-3)的蛋白水平,降低抑制凋亡基因(Bcl-2)的蛋白水平,且均与对照组有显著差异;而LY294002可增强JB的效应,且与JB组有显著差异.结论 JB可抑制人卵巢癌Skov3细胞的增殖,促进细胞凋亡,可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路和诱导死亡受体表达来发挥抗肿瘤作用的.
关键词： 岩大戟内酯B 人卵巢癌SKOV3细胞 增殖抑制 PI3K/Akt途径 -
岩大戟内酯B对耐阿霉素白血病细胞株HL-60/ADR细胞凋亡的影响及其机制
目的 探讨死亡受体通路在岩大戟内酯B诱导的耐阿霉素白血病细胞株HL-60/ADR细胞凋亡中的作用.方法 采用Annexin Ⅴ异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(FITC/PI)双染流式细胞术检测HL-60/ADR细胞凋亡;利用Western blot检测Fas/FasL蛋白的表达;采用荧光比色法测定细胞内caspase-8和caspase-3蛋白酶活性.结果 HL-60/ADR细胞的凋亡率随着岩大戟内酯B浓度的增加及作用时间的延长而逐渐增加.当岩大戟内酯B浓度为40 mg·L-1时,作用24、48及72 h后早期凋亡率和总凋亡率与0h比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001);当浓度为20、40、80 mg·L-1时,作用48 h后早期凋亡率和总凋亡率与0 mg·L-1比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001).Fas/FasL蛋白的表达随着岩大戟内酯B作用时间的延长逐渐增加;caspase-8和caspase-3蛋白酶的活性亦逐渐增加.作用24、48及72 h后caspase-3和caspase-8蛋白酶活性与0h比较,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.001).结论 岩大戟内酯B能够诱导耐阿霉素白血病细胞株HL-60/ADR细胞凋亡,Fas/FasL通路参与了岩大戟内酯B诱导的HL-60/ADR细胞凋亡过程.
关键词： 岩大戟内酯B HL-60/ADR细胞 细胞凋亡 -
蒙药塔日奴中岩大戟内酯B和狼毒乙素的RP-HPLC法分析
目的 建立反相高效液相法同时测定蒙药塔日奴中岩大戟内酯B和狼毒乙素含量.方法 采用90％的乙醇溶液回流提取制备供试品.分析色谱柱为CenturySIL C18BDS(250 mm ×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～60 min;98％～0％B;2％～100％A),流速0.8 ml·min-1,检测波长227 nm.结果 蒙药塔日奴中岩大戟内酯B及狼毒乙素标准曲线的回归方程依次为Y=458411X+1704565 (r=0.9999),Y=127938X-168409(r =0.9998),在1.871 ～9.355 μg,0.1856～0.928 μg范围内线性关系良好,平均回收率分别为99.5％和95.5％,RSD分别为3.2％和1.0％.结论 所建立的HPLC含量测定法快捷、准确、重现性好,可用于蒙药塔日奴中岩大戟内酯B和狼毒乙素的含量测定.
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狼毒商品药材中岩大戟内酯B含量的高效液相色谱法测定及其品质评价
目的 以岩大戟内酯B的含量为指标,评价21批狼毒商品药材的质量.方法 采用HPLC法测定21批月腺大戟或狼毒大戟来源的狼毒药材中岩大戟内酯B的含量,Agilent C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm),乙腈-水(65:35)为流动相,流速1.0 ml·min-1,柱温30℃,238nm紫外线检测.结果 岩大戟内酯B在2.125～27.2μg·ml-1范围内浓度与峰面积成良好线性关系(r =0.9999),按干燥品计算21批狼毒药材中岩大戟内酯B的含量为0.00910％ ～0.04161％,其中狼毒大戟中的岩大戟内酯B的含量高于月腺大戟.结论 岩大戟内酯B可作为狼毒药材鉴定和质量控制的指标成分,研究结果为完善其质量标准提供了科学依据.
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狼毒质量标准改进研究
目的 研究和完善狼毒药材的质量标准.方法 采用薄层色谱法对狼毒药材中的24-次甲基环木菠萝烷醇和岩大戟内酯B进行了鉴别；采用高效液相色谱(HPLC)法对狼毒乙素和岩大戟内酯B进行了含量测定.结果 狼毒薄层鉴别专属性强,方法可行；狼毒乙素线性范围为0.013～0.863 μg (r=0.9999),平均回收率为96.4％(RSD=1.4％,n=6)；岩大戟内酯B线性范围为0.007～0.496 μg (r=0.9999),平均回收率为96.0％(RSD=2.1％,n=6).结论 此方法准确、可靠,为狼毒药材的质量评价提供了依据.
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RP-HPLC法测定狼毒中狼毒乙素和岩大戟内酯B的含量
目的:建立同时测定狼毒药材中狼毒乙素和岩大戟内酯B的HPLC定量分析方法.方法:采用Lichrospher C18(4.6 mmx250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈(A)-水(B)为流动相梯度洗脱(0-5 min,40%A;5-10 min,40% A→50% A; 10-30 min,50%A→55%A;30-40 min,55%A→60%A;40-45min,60%A→70%A),流速1.0 mL·min-1;检测波长226nm,柱温30℃.结果:狼毒乙素线性范围为0.005-0.863μg(r=0.9999),平均回收率为96.4%(RSD=1.4%,n=6);岩大戟内酯B线性范围为0.003-0.496μg(r=0.9999),平均回收率为96.0%(RSD=2.1%,n=6).结论:本方法专属性强,结果准确,简便可行,可用于狼毒药材的质量控制.
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RP-HPLC法测定狼毒中岩大戟内酯A和B的含量
目的:建立测定狼毒药材中2个二萜内酯类成分岩大戟内酯A和B的HPLC定量分析方法.方法:采用C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),乙腈-水(75:25)洗脱,流速为1.0 mL·min-1,检测波长为250 nm.结果:狼毒大戟和月腺大戟中普遍含有岩大戟内酯A和B,2个成分的含量范围分别为0.007%～0.043%和0.012%～0.204%.瑞香狼毒和海芋中不含有这2个成分.结论:本方法专属性强,结果准确,简便可行,适用于狼毒药材中岩大戟内酯A和B的含量测定.
