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登革2型病毒及其NGC株、M株E基因的原核蛋白对HUVEC通透性的影响
目的:研究登革2型病毒(DENV-2)、登革2型病毒国际参考株(NGC)E基因1-476序列原核蛋白、登革2型病毒贵州蚊虫分离株(M)E基因1476序列原核蛋白对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)通透性的影响.方法:将DENV-2 M株和NGC株E基因1-476序列原核表达产物及DENV-2接种于HUVEC单层细胞,用tran-swell法检测HUVEC的通透性,透射电镜观察细胞超微结构的改变.结果:DENV-2、NGC株E基因的原核蛋白、M株E基因的原核蛋白分别在30 min、3h、12 h时对HUVEC通透性的影响为明显,透射电镜结果显示有细胞超微结构的改变.结论:DENV-2、DENV-2 NGC株E基因原核蛋白、M株E基因原核蛋白对HUVEC通透性、细胞超微结构有明显影响.
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登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建
目的: 克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体.方法: 用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1(+)的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1,转化Ecoli DH5a.阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定.电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况.结果: 阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为 413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达.结论: 成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1(+)-NS1.
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登革2型病毒NGC株感染白纹伊蚊C6/36细胞中浓核病毒DNA的扩增和序列测定
目的:探索白纹伊蚊C6/36细胞对登革2型病毒(Dengue Type 2 virus,DEN2)不敏感的原因.方法:根据Genbank提供的DEN2新几内亚株(NGC株)NS1基因序列设计引物,设立病毒对照组、病毒DNA酶(DNase)处理组和细胞对照组,通过提取核酸、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、限制性内切酶(Hind Ⅲ)酶切、1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR及其酶切产物,并对其扩增产物进行序列测定,用软件比对与白纹伊蚊C6/36细胞浓核病毒(Densonucleosis virus,DNV)基因的同源性.结果:经RT-PCR,细胞和病毒组均出现约1 300 bp的条带,不能被Hind Ⅲ酶切,而病毒DNase处理组未能扩增出此条带;经GenBank比对,该片段序列与白纹伊蚊C6/36细胞DNV部分序列的同源性达95%以上.结论:C6/36细胞对DEN2不敏感的原因是由于伊蚊C6/36 DNV的污染.
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登革2型病毒NGC株E基因部分序列原核蛋白表达
目的:构建登革2型病毒NGC株E基因区1～476 bp的原核表达载体并进行原核表达.方法:将登革2型病毒NGC株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-En;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE、Western印迹鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的TCID50.结果:(1)成功构建了pET28a(+)-En原核表达重组质粒,SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,相对分子量约为23 kD,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western印迹表明该目的蛋白可与登革2型病毒鼠单克隆抗体结合;(2)用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%;(3)DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-4.88/0.1 ml.结论:pET28a(+)-En可在BL21(DE3)菌株中高效表达,DEN-2 NGC株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有一定的细胞毒作用.
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不明原因发热病人血清中2型登革病毒特异性抗体的检测
目的:了解贵州省夏秋季不明原因发热病人中2型登革病毒的感染情况.方法:收集贵州省不同地区2002和2003年夏秋季不明原因发热病人血清364份,用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗2型登革病毒特异性IgM,IgG类抗体.结果:病人血清抗2型登革病毒特异性IgG类抗体平均阳性率为12.6%,特异性IgM类抗体平均阳性率为18.4%,特异性IgG,IgM类抗体均阳性为4.7%.42份病人双份血清中,抗2型登革病毒特异性IgG类抗体效价增高4倍或以上为13份(31%);结论:贵州省夏秋季发热病人部分为2型登革病毒感染.
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登革热病毒Ⅱ型临床株感染小鼠TH1/TH2类细胞因子的产生
目的: 观察登革病毒2型临床分离株B株(DEN2 B)感染Balb/c小鼠后,其血浆中γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2,4,5,6,10(IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10)、β-转化生长因子(TGF-β)的动态变化,并探讨DEN2 B株感染后小鼠Ⅰ型辅助性T细胞(TH1)、Ⅱ型辅助性T细胞(TH2)应答机制及其相关关系.方法: 1.用不同剂量DEN2 B株经皮下多点注射感染Balb/c小鼠,建立动物模型;2.双抗体夹心ELISA法检测不同剂量DEN2 B株感染后各组动物血浆中(体内)IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β的产生动态.结果: 1.DEN2 B株感染动物后,各剂量组动物血浆中均检出特异性抗DEN2 IgM,IgG类抗体,出现病毒血症及不同程度临床表现,建立了DEN2 B株感染Balb/c小鼠动物模型;2.DEN2 B株感染动物后,其血浆IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β水平在感染后不同时期均出现不同程度增加,各种细胞因子水平变化情况与正常组差别有统计学意义(P<0.05).各种细胞因子产生动态有差异.结论: IFN-γ,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,TGF-β等细胞因子与登革病毒感染所致疾病病情关系密切,DEN2 B株再次感染阶段以TH2应答为主.
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皮下注射登革热病毒-2型建立Balb/c小鼠感染模型
目的:经皮下注射登革热病毒-2型(DEN-2),建立Balb/c小鼠感染模型,观察DEN-2不同毒株感染情况.方法: 用DEN-2 NGC株和临床分离株(B株)以不同剂量经皮下多点注射方式感染Balb/c小鼠,通过测量初次、再次感染后小鼠的体温、血小板数量、分离血浆中病毒、间接ELISA检测特异性抗体,观察动物感染模型建立情况.结果: (1) 初、再次感染后实验动物可出现弓背、耸毛、震颤、低热、血小板数量降低等登革热(DF)临床表现,从血浆中检测到抗DEN-2 IgM,IgG类抗体,并分离到病毒;(2)两株病毒感染后实验动物的血小板数量及病毒血症期及特异性抗体的变化存在一定的差异.结论: 经腹部皮下多点注射DEN,模拟自然感染方式可建立BALB/C小鼠感染模型,其感染情况与感染剂量、感染毒株有关.
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通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型
目的: 利用通用引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒RNA,并经限制性内切酶酶切鉴定病毒型别.方法: 用C6/36细胞培养登革病毒,碘化钠法提取病毒RNA,利用通用引物进行RT-PCR,对PCR产物用MavⅠ限制性内切酶酶切鉴定.结果:应用通用引物RT-PCR方法可检测到含量为0.212 ng/L的病毒RNA,扩增的产物及酶切片段与预期的靶序列长度和限制酶谱分析相一致.结论:用登革病毒NS1区通用引物通过RT-PCR并经酶切分型,是诊断登革病毒感染的一种简易快速的方法.
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白纹伊蚊贵州地方株垂直传播登革1型病毒的研究
目的: 研究白纹伊蚊贵州地方株对1型登革病毒(DEN-1)的垂直传播能力.方法: 用DEN-1感染白纹伊蚊贵州3个地方株(贵阳、毕节、兴义),收集亲代及子1～3代蚊虫标本,提取蚊体总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒核酸.并以白纹伊蚊海南株作为对照.结果: 感染DEN-1后的白纹伊蚊贵阳株亲代、子1代;白纹伊蚊毕节株亲代、子1代;白纹伊蚊兴义株及海南株亲代、子1～3代的蚊体内均可检测到病毒核酸.结论: DEN-1均能通过白纹伊蚊贵州3个地方株垂直传播.白纹伊蚊贵州不同地方株对DEN-1的垂直传播能力有差别.
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白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播登革病毒实验研究
目的: 研究白纹伊蚊贵州麻尾株对2型登革病毒(DEN-2)的经卵传递能力.方法: 用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州麻尾株,收集亲代及子1、2、3代蚊虫标本,提取亲代及子代蚊体内病毒总RNA,通过RT-PCR扩增蚊体内DEN-2病毒核酸,并用限制性核酸内切酶HinfⅠ酶切鉴定.结果: 感染白纹伊蚊贵州麻尾株后,子1～3代蚊体内均可检测出病毒核酸.结论: DEN-2能通过白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播,至少可以传3代.
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白纹伊蚊垂直传播登革病毒后E基因区部分序列的变化
目的: 通过对登革病毒经垂直传播后亲代和子一代蚊体内病毒基因序列的分析,了解登革病毒在流行过程中的变异性.方法: 用登革2型病毒(DEN-2) NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株,提取亲代及子一代蚊体内病毒总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增蚊体内DEN-2病毒核酸,对阳性聚合酶链反应(PCR)产物进行序列测定和比较.结果: 用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州兴义株后,子一代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区序列与亲代蚊体内扩增的序列比较,出现3个位点的突变,分别位于第174,215,336位点;亲代蚊体内扩增的DEN-2 E基因区部分序列与DEN-2 NGC株E基因区序列相同.结论: DEN-2在垂直传播后出现病毒E基因区的点突变.
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用RT-PCR方法检测登革病毒E基因核酸
目的: 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术建立检测登革2型病毒E基因的方法.方法: 分别抽提登革2型病毒NGC株和从登革出血热病人血清中分离得到的2型登革热病毒(DV)核酸 (RNA), 合成cDNA第一链, 经过RT-PCR得到cDNA产物,用HinfⅠ限制性内切酶酶切鉴定.结果: 通过RT-PCR检测登革2型病毒核酸.结论: 登革2型病毒E基因核酸的RT-PCR检测方法的建立为快速诊断登革病毒感染提供了可靠的方法.
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用登革Ⅲ型病毒免疫小鼠后特异性IgG抗体的动态变化
目的:以登革Ⅲ型病毒(DV3)免疫成年BALB/C小鼠,观察血液中特异性IgG抗体的动态变化.方法:以不同剂量DV3经皮下注射和肌肉注射接种成年BALB/C小鼠,用间接免疫荧光法检测不同时间机体末梢血中特异性IgG抗体及其水平.结果:不同剂量DV3免疫BALB/C小鼠均可诱导体液免疫应答,特异性IgG抗体于免疫后第8～12天开始产生,于第15～18天达高峰(1∶80),继而下降.特异性IgG类抗体可维持47 d以上,其中以1 000TCID50DV3免疫BALB/C小鼠早产生特异性抗体且水平高.结论:经皮下和肌肉注射DV3,可诱导BALB/C小鼠产生特异性IgG类抗体.
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贵州省部分县市健康人群登革热感染情况调查
登革热是一种被蚊虫叮咬后引起的急性传染病,广泛流行于热带和亚热带地区,是一种分布广、危害大的虫媒病毒性疾病.在我国传播媒介主要为埃及伊蚊和白纹伊蚊.目前在我国的广东、海南、广西、福建等省均有报告病例,并且在一些未出现登革热流行的省份,例如云南省的白纹伊蚊中已分离出登革热病毒.我国登革热病例流行集中在3～11月份,7～9月是高峰期[1].贵州省地处亚热带地区,西接云南,毗邻广西,为进一步了解贵州省健康人群中登革热的感染情况,于2011年4～11月开展本实验研究.1 材料和方法1.1标本来源 选取贵阳市云岩区、黔东南州从江县和黔南州罗甸县三个县(市),分别选取一个村寨及周围村寨作为监测点,在4月对监测点健康人群进行第一次采血,每个点采集血清标本300份,同年11月再对第一次被采血人群进行第二次采血.
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Ⅰ型登革热病毒细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定
登革热病毒( DENV)严重威胁全球人类健康,而且这种威胁在不断加剧,DENV特异性CD8+ T细胞在病毒感染中的确切作用还未搞清。此研究中作者将SYFPEITHI算法用于Ⅰ型登革热病毒( DENV-1)潜在表位氨基酸序列的筛选。合成了在数百种DENV-1病毒株中保守的7个HLA-A 1101限制性和5个HLA-A 2402限制性推定的表位。用竞争性肽结合试验对这些表位候选物与相应HLA分子的结合亲和力进行评价。 HLA-A 1101转基因小鼠, HLA-A 2402转基因小鼠及感染DENV-1患者的外周血单核细胞( PBMCs)被用于检测多肽的免疫原性及特异性。竞争性肽结合检测法算出的抑制百分比(PI)显示,6种肽(E39-47PTLDIELLK、S5(505-513) GVEGEGLHK、NS2 b (15-23) SILLSSLLK、NS5(561-569)ALLATSIFK、NS3(99-107)AVEPGPNPK和NS4b(159-167) VVYDAKFEK)与HLA-A1101分子有高度的亲和力,5种肽( NS3472-480QYIYMGQPL、 NS4a40-48AYRHAMEEL、 NS5(880-888) DYMTSMKRF、NS3(548-556) SYKVA-SEGF 和 NS3(22-30) IYRILQRGL )与 HLA-A2402分子有高度的亲和力。酶联免疫斑点法( ELISPOT)结果显示这些高亲和力的多肽被DENV-1感染的转基因小鼠的脾细胞所识别,并且被这些多肽免疫的转基因小鼠显示了高水平的肽特异性IFN-γ分泌细胞。另外,肽脉冲过的脾细胞及DENV-1感染的脾单核细胞都被这些肽特异性细胞毒性淋巴细胞有效杀死。10种高亲和力的多肽中除NS2 b (15-23)之外,俱被DENV-1感染病人的PBMCs所识别。这些表位的鉴定对理解DENV特异性CD8+ T细胞的功能有所助益。
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2013年珠海西区25例登革热的临床分析
目的:探讨登革热的临床特征.方法:对25例确诊的登革热患者临床资料进行回顾性分析.结果:25例患者中发热占100％,头痛占80％,肌痛占72％,皮疹占68％.25例患者登革热IgM抗体均阳性,阳性率为100％,白细胞和血小板减少分别占80％和68％,丙氨酸氨基转移酶(ALT)升高占7％,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)升高占93％,尿蛋白阳性28％.结论:本次珠海西区流行的登革热临床症状轻,部分合并肝、心、肾损害,临床转归好.
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福建北部首次登革热暴发疫情分子流行病学研究
目的 分析闽北2014年登革热暴发疫情的病因,从分子水平探讨流行毒株的生物学特征,追踪其地域来源.方法 采集医院就诊人员中登革热患者血清标本并进行流行病学调查,RT-PCR检测登革病毒核酸,核酸阳性标本进行登革病毒E基因核苷酸序列测定分析.结果 采集8份血清标本中,分离到7株登革病毒1型(DENV1)毒株,1株登革病毒2型(DENV2)毒株.根据序列比对和亲缘性系统进化树,编号为S030、S073、S126、S185、S186和S197的登革热1型病毒样本,与亚洲的毒株AY762084.1、EU179860.1、AY732474.1、JQ917404.1、FJ478458.1、KR071622.1、KR052012.1和KP686070.1亲缘关系较近,同源性较高.编号为S078的登革热2型病毒样本,与亚洲的毒株EU081178.1,EF051521.1,DQ645556.1,KP012546.1亲缘关系接近,其中与广东的毒株KP012546.1近,同源性较高.结论 DENV1的毒株与亚洲中国中原1型的毒株同源性较高,推测这些样本均由亚洲地区输入到中国,并在中国中原湖北、河南以及福建分散流行.DENV2的毒株由广东输入到闽北地区.
