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~(125)碘标记三链形成寡核苷酸对肝癌细胞中病毒复制和细胞生长的抑制作用
目的 探讨~(125)碘(I)标记三链形成寡核苷酸(TFO)与乙型肝炎病毒(HBV)DNA的特异性结合能力及其对肝癌细胞HepG 2.2.15中病毒复制及细胞生长的抑制作用.方法 合成能与HBV前S基因特异结合的TFO,并以~(125)I标记.将HepG 2.2.15细胞分别与~(125)I-TFO实验组(125I-TFO组)、等量TFO对照组(TFO组)、相同放射性活度的钠~(125)碘(Na~(125)I)组和空白对照组共同培养,荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞培养液中HBV DNA拷贝量变化,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后各组细胞的存活率.结果 RT-PCR显示转染48 h后,4组间病毒拷贝数量的差异有统计学意义(P<0.01),~(125)I-TFO组对病毒复制的抑制作用显著强于空白对照组(P<0.01)、~(125)I对照组(P<0.01)和TFO组(P<0.01);TFO组的抑制病毒复制作用显著强于空白对照组(P(0.05).转染24、48、72 h,~(125)I-TFO组对HepG 2.2.15细胞的生长抑制作用显著高于其他3组(P值均<0.01),并随时间的增加~(125)I-TFO对细胞生长的抑制作用呈线性上升趋势.结论 ~(125)I-TF0可有效地抑制肝癌细胞中HBV的复制及肝癌细胞的生长,为今后制备抗HBV、抗HBV相关肝细胞癌的放射性基因治疗药物奠定了基础.
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兔血清浓度对肝癌细胞系2.2.15细胞培养的影响
乙肝病毒严重危害人体健康,目前尚无特效药.美国人Sells 1989年建立了能稳定分泌病毒颗粒的2.2.15肝癌细胞系[1],自此针对乙肝病毒的体外药物实验开展得很多[2～6],但大多是观察药物直接对细胞和病毒的作用.考虑到人体自身对药物的分解吸收的影响,这样的实验结果还不能如实反映药物的实际疗效.而药物血清方法可避免了这些缺点.药物血清中血清浓度过高过低都会影响细胞正常的生长活动,并且过低时血清中的药物对细胞的作用不显著.制定药物血清的浓度需要确定血清在整个培养液中的适浓度,以往人们习惯用小牛血清.鉴于小牛血清的价格高且来源少,我们尝试在正常培养液中加入兔血清来部分代替,并以此确定肝癌细胞系2.2.15正常生长所能忍受的兔血清高浓度.
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水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV DNA、cccDNA的抑制作用
目的 观察水芹总酚酸对2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的抑制作用.方法 药物稀释成500、250、125 mg·L-1加入2.2.15细胞进行培养,每4 d换含同浓度药物培养液;分别收集d 4、8以及停药后4 d的细胞,试剂盒提取HBV-DNA、cccDNA,荧光定量PCR(FQ-PCR)测定其含量,观察水芹总酚酸对其抑制作用.结果 水芹总酚酸对HBV-DNA和cccDNA都具有很好的抑制作用,在细胞培养的d 8其高、中剂量(500、250 mg·L-1)的抑制作用达到大: HBV-DNA为62.3%和47.7%,cccDNA为62.7%和61.3%,且在停药后3 d仍保持较高的抑制率(P<0.05).结论 水芹总酚酸可以有效的抑制2.2.15细胞HBV-DNA、cccDNA的表达,抗病毒作用明显,且无明显的停药反跳现象.
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针对HBV S基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探
目的探讨针对HBV S基因翻译起始区的反义锁核酸(LNA)片断体外抗乙型肝炎病毒表达的作用.方法合成三段均互补于HBV S区同一位点的反义核酸片断:锁核酸、反义寡核苷酸、全硫代反义寡核苷酸及无关对照序列,作用于HepG22.2.15细胞,采用ELISA法动态检测细胞上清中HBsAg含量的变化并比较其抗HBV抗原表达作用,以四甲基偶氮唑兰(MTT)法检测LNA对细胞的毒性.结果三段反义寡核苷酸均能抑制HBsAg的表达,作用7d后抑制率分别为52%、42%、45%,其中LNA抗病毒活性强且对细胞代谢无影响,无关序列无明显抑制作用.结论针对HBV S区的锁核酸体外能有效抑制乙型肝炎病毒的表达,为乙肝的分子治疗开辟了新的前景.
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土贝母皂苷体外抗乙型肝炎病毒的药效研究
目的 观察土贝母皂苷体外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果.方法 以2.2.15细胞为靶细胞,给药后通过检测细胞表面及培养液中HBsAg,HBeAg和HBV-DNA,观察土贝母皂苷抗HBV效果.结果 土贝母皂苷各浓度组对HBsAg,HBeAg表达均有抑制作用,但以0.1 mg/ml作用48 h时强,分别为43.46%和54.52%(P＜0.01);对HBV-DNA的抑制作用以1 mg/ml组显著(P＜0.05).结论 土贝母皂苷在体外有抗乙型肝炎病毒(HBV)作用.
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小分子肽抗乙型肝炎病毒的实验研究
目的:应用2.2.15细胞株和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)感染模型,评价小分子肽CMS 017抗乙肝病毒作用.方法:①CMS 017以倍比稀释浓度加入2.2.15细胞培养中,作用8天后吸取培养上清,PCR法检测HBVDNA.②建立DHBV感染模型,CMS017以60、200、600μg/kg·d-13个剂量腹腔注射给药28天,检测用药前、后血清DHBV DNA、DHBsAg变化.结果:①CMS 017体外抑制DHBV呈量效关系,IC50为2.3μg/ml.②鸭体内实验中,CMS 017中、高剂量组用药7天、14天开始出现血清DHBV DNA降低(P＜0.01,P＜0.05),持续至停药后7天.CMS 017中剂量组用药后血清DHBsAg降低的时效关系与DHBV DNA完全一致.结论:CMS017具有抗乙肝病毒作用,其体内作用的量效关系待确定.
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愈肝胶囊对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用
目的:观察愈肝胶囊对HBV转染细胞表达功能的影响.方法:本研究以乙型肝炎病毒(HBV)基因转染的人肝癌细胞系2.2.15细胞作为筛选抗HBV药物的细胞模型,观察愈肝胶囊对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的影响;并以四甲基氮唑蓝(MTT)比色法检测药物对细胞的毒性.结果:愈肝胶囊对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有显著抑制作用,半数中毒剂量(TC50)为1.79mg/ml,对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg抑制率分别为70.81%,83.96%;半数有效剂量(ID50)HBsAg为0.86,HBeAg为0.13.治疗指数(TI)分别为HBsAg2.08,HBeAg 13.76.结论:愈肝胶囊在体外有一定的抗HBV作用.
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肝康栓的体外抗乙型肝炎病毒作用的研究
观察肝康栓对抗乙型肝炎病毒(HBV)体外药效评价,进一步探讨其抗病毒机制.方法:利用乙型肝炎病毒基因转染的2.2.15细胞系,用不同浓度的肝康栓作用于此细胞系,留取培养上清液.用ELISA、PCR技术检测上清液中的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)及乙肝病毒DNA(HBV DNA)的含量作为药物抗HBV效果的观察指标.结果:肝康栓能有效抑制上清液中的HBeAg和DNA浓度,但对HBsAg作用不明显.结论:肝康栓是一种有效的抗乙肝病毒的药物.
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Bay41-4109抗乙型肝炎病毒的体外实验研究
目的 观察Bay41-4109对2.2.15细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA的影响,探讨Bay41-4109的体外抗HBV作用.方法 将一定浓度的Bay41-4109加入培养的2.2.15细胞,通过四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法观察药物对细胞的毒性作用;应用酶联免疫吸附剂测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)及实时荧光定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)分别检测药物对细胞分泌HBsAg、HBeAg和HBV DNA的影响.结果 Bay41-4109在12.5～50 μM的浓度范围内,对2.2.15细胞的毒性作用逐渐增加,TG<,50>为35.43 μM;酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked irnmunosorbent assay,ELISA)结果显示,Bay41-4109对2.2.15细胞分泌HBehg有明显的抑制作用并有一定的剂量依赖关系,其IC<,50>为8.22μM;荧光定量PCR法结果分析显示Bay41-4109能使2.2.15细胞上清HBV DNA的含量明显下降.结论 Bay41-4109对2.2.15细胞分泌HBeAg和HBV DNA有一定的抑制作用.
关键词： Bay41-4109 2.2.15细胞 乙型肝炎病毒 -
广西藤茶提取物TTF含药血清对乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的抑制作用
目的 观察从广西藤茶中提取出的一有效部位TTF抗乙型肝炎病毒的作用.方法 采用MTT法观察TTF含药血清对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用.结果 TTF含药血清对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg有显著抑制作用.结论 TTF可明显抑制2.2.15细胞HBsAg、HBeAg的分泌,提示TTF具有抗HBV的作用.
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叶下珠复方Ⅱ号抗乙型肝炎病毒的体外实验研究
目的 评价叶下珠复方Ⅱ号体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 观察不同浓度叶下珠复方Ⅱ号对体外培养的2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的影响. 结果 叶下珠复方Ⅱ号对2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为16.94mg/ml,对HBsAg和HBeAg的半数有效浓度(IC50)分别为7,82、7.60 ms/ml,治疗指数分别为2.17、2.23. 结论 叶下珠复方Ⅱ号对2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg有较好的抑制作用.
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甘草酸苷与乙型肝炎病毒复制关系的体外研究
目的:研究甘草酸苷在体外试验条件下与乙型肝炎病毒复制的关系.方法:以2.2.15细胞株为试验对象,定量检测加入不同浓度甘草酸苷处理后细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg的含量.结果:甘草酸苷浓度分别为800、400、200、100、50μg/ml时,对HBsAg抑制率依次为83.8%、71.0%、62.1%、52.0%、29.7%,表明其可抑制2.2.15细胞分泌HBsAg.结论:甘草酸苷在体外试验中未引起HBV复制活跃.
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阿的福韦在鸭乙型肝炎模型及2.2.15细胞中抗乙型肝炎病毒的药效研究
目的:观察阿的福韦体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)的作用及体外抗乙型肝炎病毒(HBV)效果.方法:采用鸭乙型肝炎动物模型,用阿的福韦口服治疗10天,检测用药前后血清中的DHBV DNA、DHBsAg,并取肝脏样本提取总DNA,作Southern Blot分析.此外,以2.2.15细胞为靶细胞,给药后通过检测细胞培养液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA观察阿的福韦抗HBV效果.结果:阿的福韦各剂量组用药后均能使血清中的DHBVDNA显著降低或极显著降低(P＜0.05或P＜0.01),但停药后有DHBV DNA回升现象;用药前后DHBsAg无明显改变.肝组织Southern Blot分析亦显示用药后肝脏中DHBV DNA有明显降低,停药后DHBV DNA反跳明显.大剂量阿的福韦加入细胞培养12天,对HBsAg抑制率为17.01%,对HBeAg抑制率为26.80%,对HBV DNA抑制率为26.92%.结论:阿的福韦在鸭体内有抗鸭乙型肝炎病毒的作用,但停药后DHBVDNA有"反跳"现象;体外实验无明显抗HBV病毒作用.
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中草药提取物体外抑制HBV的筛选实验
目的：以乙型肝炎病毒(HBV)DNA转染的细胞株2.2.15细胞为靶细胞，给药后通过检测细胞培养液中HBsAg和HBeAg滴度，对四种中药抗HBV效果进行评价。方法：在2.2.15细胞培养基中分别加入不同浓度的药物，培养数天后检测上清液中HbsAg和HBeAg滴度，计算药物对DNA表达的抑制率(ID50)；用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法检测药物对细胞的毒性，计算出半数中毒计量(LD50），用治疗指数(TI)判断药物的抗HBV病毒作用。结果：槲寄生和甘草的水提取物有较好的抗HBV作用；芫花提取物则有较大的细胞毒性。白薇提取物的抗HBV病毒作用不显著。结论：本实验方法作为快速体外筛选模型简便易行，对于槲寄生和甘草的抗HBV作用有进一步研究的价值。
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一枝蒿有效部位抗乙肝病毒作用研究
目的:研究一枝蒿有效部位体内外抗乙肝病毒的作用.方法:采用2.2.15细胞模型,以HBV-DNA、HbsAg及HBeAg 作为药效评价指标,研究一枝蒿有效部位体外抗乙肝病毒的作用;体内实验采用DHBV-DNA阳性鸭血清感染雏鸭,建立鸭乙型肝炎病毒感染模型,一枝蒿有效部位12.5、25和50 mg/kg灌胃给药14天,以HBV-DNA作为药效评价指标,研究其体内抗乙肝病毒的作用.结果:体外实验一枝蒿有效部位0.59 ～ 16.05μg/ml对2.2.15细胞HBV-DNA(抑制率9.02％)、HbsAg(抑制率35.31％)、HbeAg(抑制率11.58％)具有一定的抑制作用;体内实验一枝蒿有效部位50 mg/kg可显著降低鸭血清DHBV-DNA水平.结论:一枝蒿有效部位具有一定的体内外抗乙肝病毒作用.
关键词： 一枝蒿 2.2.15细胞 鸭乙型肝炎病毒感染模型 HBV -
选择性聚合酶链反应检测 2.2.15 细胞内HBV cccDNA
0 引言1986年美国Sells等(The Mount Sinal Medical Center)将HB V基因转染到人肝癌细胞(HepG2)中,获得了能表达HBV标志的细胞株2.2.15细胞,并以此作为模型筛选抗HBV的药物,进行基因结构及功能的研究. 然而HBV在2.2.15细胞中复制方式与自然感染的肝细胞有何不同,有无HBV 的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)存在, 各学者说法不一[1.2],我们应用选择性PCR技术,检测了2.2.15细胞内的HBV cccD NA,现简报如下.
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苍耳子提取物抗HBV体外实验研究
目的:研究苍耳子提取物在体外抗HBV的作用.方法:以乙型肝炎病毒(HBV)DNA传染的HepG2.2.15细胞为靶细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法筛选出苍耳子提取物和拉米夫定(3TC)的无毒浓度后,分别加入不同浓度的0.1 mg/ml、0.01 mg/ml、0.001 mg/ml苍耳子提取物,3TC 浓度为50 μg/ml, 2d、4d、6d后,检测上清液中HBsAg、HBeAg滴度和HBV DNA拷贝数.结果:苍耳子提取物(0.1 mg/ml)组能抑制2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg表达,但对HBV DNA无作用.结论:苍耳子提取物对HBV的HBsAg、HBeAg有一定抑制作用.
