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冷缺血损伤对大鼠供肾转化生长因子β1表达的影响
目的 探讨冷保存对转化生长因子β 1(TGFβ 1)在大鼠肾小管上皮细胞表达的影响.方法 选择Wistar大鼠40只,采取原位灌注整块肾脏切取,HC-A(肾脏保护液)灌注,在0～4℃下分别保存0,12,24,36和48 h,采用免疫组织化学术,原位杂交术分别检测肾小管上皮细胞TGFβ1表达水平.结果 在0 h组,12 h组大鼠肾小管上皮细胞中TGFβ1极少表达,两组TGFβ1蛋白,mRNA平均阳性单位(PU值)分别为(6.37±2.77),(5.29±2.15);(6.11±1.82),(5.90±2.40);差异均无显著性(P>0.05).随着冷缺血时间延长至24、36及48 h,TGF β 1蛋白,mRNA表达逐渐增加[24 h组PU值分别为(10.20±3.27),(11.32±3.34);36h组PU值分别为(13.84±3.91),(15.47±4.21);48 h组PU值分别为(17.17±3.96),(19.01±3.53)],各组间比较差异有显著性(P<0.05),各组与0h,12h组相比较差异亦有显著性(P<0.05).结论 冷缺血损伤促进大鼠肾脏转化生长因子-β 1表达增加,促进细胞外基质的合成.
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缺血预处理对大鼠移植肠冷缺血/再灌注损伤的保护作用
目的 探讨缺血预处理(IP)对不同冷保存时间大鼠移植肠的保护作用.方法 将80只SD大鼠随机分为2组:即非预处理组(0-L组)与预处理组(L组),每组分别再分为4小组,按冷缺血时间分为3(L3)、6(L6)、12(L12)及18(L18)组,每组10只.建立大鼠缺血预处理模型,将各组供肠冷保存相对应时间.供肠行原位移植后再灌注1 h取材,对其进行组织学观察,并观测NF-κB的表达.结果 相同冷缺血时间的预处理组损伤明显较非预处理组轻,表现为预处理组较非预处理组小肠绒毛排列整齐,肌层水肿较轻,Chiu氏评分升高.预处理组较非预处理组上皮细胞NF-κB的表达减弱(P＜0.05).结论 缺血预处理对不同冷保存时间移植肠具有保护作用.
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乳化氟碳保存液对离体保存肾脏抗氧化能力及组织结构的影响
目的：观察乳化氟碳保存液和高渗枸橼酸盐嘌呤溶液对低温保存肾脏抗氧化能力和超微结构的影响，探讨乳化氟碳保存液在供体肾脏保存中的作用。方法：选择24只雄性SD大鼠随机分为高渗枸橼酸盐嘌呤溶液组（HCA）和乳化氟碳液组，每组12只。分别采用乳化氟碳保存液和高渗枸橼酸盐嘌呤溶液原位灌注双侧肾脏后快速切取，置于0～4℃20 mL上述相应液体中保存24 h后，比较两组保存液对大鼠肾脏的肾皮质匀浆MDA含量、SOD活性及Bcl-2基因表达和形态学改变。结果：乳化氟碳液组肾皮质匀浆MDA含量明显低于HCA液组（P＜0.05），SOD活性、Bcl-2基因表达明显高于HCA液组（P＜0.05），病理评分低于HCA液组（P＜0.05），肾小管上皮细胞损伤轻于HCA液组。结论：乳化氟碳液可提高供体肾抗氧化和抗凋亡能力，减轻供体肾保存期的肾损伤。
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肝移植中肝脏保存损伤及保护策略研究进展
肝脏保存是肝移植中至关重要的一个环节,冷保存是当前临床肝脏移植标准的器官保存方法.移植物功能不全发生于肝移植术后的早期并且影响了每个移植肝脏,通常称为"保存损伤",但影响因素远远超出了"保存损伤"的字面含义.本文旨在用述肝脏保存损伤的机制以及减轻保存损伤的保护策略的研究进展.
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不同灌注方法对保存期大鼠供肝胆管细胞的影响
目的:研究灌注肝动脉和冲洗胆管方式在冷缺血期对大鼠供肝胆管细胞的影响.方法:各组均以威斯康星大学液(UW液)灌注大鼠供肝门静脉,以不同方式灌注肝动脉和冲洗胆管,在冷保存的不同时间段观察胆管细胞的变化.结果:冷保存 4 h后,各组光镜下胆管细胞无明显变化.冷保存 8 h后, UW液灌注大鼠供肝门静脉、肝动脉,经 UW液、Ringer's液冲洗胆管的两组胆管细胞变化较其它组变化小,并且两组之间无明显差异.冷保存 12 h后经 UW液灌注大鼠供肝门静脉、肝动脉及冲洗胆管组胆管细胞变化较其它组变化小.结论:灌注肝动脉和冲洗胆管有助胆管细胞保存, 8 h内只要能够完全清除胆盐或降低胆盐浓度,即可产生相同的保护胆管效果.随着冷保存时间的延长,应用 UW液冲洗胆管可以提高供肝胆管细胞的保存效果.
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四逆汤对供心冷保存保护作用的实验研究
目的探讨四逆汤对供心冷保存的保护作用,以达到延长供心保存时限的目的.方法新西兰大白兔16只随机分2组,A组为对照组,B组为实验组.B组取心前连续四逆汤汤剂灌胃3d.A组灌注及保存用UW液、B组则另加用四逆汤注射液.保存6h后在langendoff模型上A组用氧合的KHB液、B组用KHB液加四逆汤注射液灌注30 min.以功能、代谢和结构等指标评价供心恢复情况.结果再灌注至恢复稳定心跳节律的时间、稳定心跳时的心率、心肌收缩力恢复情况、再灌注0、5、10、15、30min各时点的冠脉流量和心肌耗氧量、再灌注前和再灌注末ATP、MDA及SOD含量、再灌注末超微结构等各项指标B组均优于A组.结论用四逆汤对供心作预处理,并在灌洗液、保存液和再灌注液中加入适量的四逆汤,对供心冷保存有保护作用,值得临床应用.
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热缺血供肝耐受冷保存时限的实验研究
心脏停搏供体是肝移植供肝来源的重要途径之一[1].有研究表明,热缺血30 min以内的供肝可考虑应用[2,3],但此类供肝本身存在热缺血损伤,在后续的威斯康星大学溶液(UW液)中能冷保存多久能为临床所用尚未可知.本实验探讨了存在热缺血10 min的供肝在UW液中冷保存的安全时限.
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雷公藤多甙对冷保存坐骨神经雪旺细胞凋亡及免疫原性的影响
目的:观察雷公藤多甙(Tripterygium glycoside,TG)对冷保存大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡和主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)表达的影响.方法:Wistar大鼠坐骨神经在0、200、400、800mg/LTG溶液(A、B、C、D组)中,4℃保存24h、3 d、7d,HE染色光镜观察,免疫组化检测Bcl-2表达,TUNEL法检测细胞凋亡.用TG溶液保存24 h的Wistar大鼠坐骨神经桥接对应组SD大鼠(A'、B'、C'、D'组)坐骨神经10 mm缺损,E'组为新鲜异体移植,移植后1、2、4周,行大体及光镜观察,免疫组化检测移植物MHC-Ⅰ、Ⅱ分子表达.结果:冷保存不同时间,各组神经纤维结构正常.保存24 h,各组间细胞凋亡差异无统计学意义(P＞0.05).保存3、7 d时,Bcl-2表达B、C组高于A、D组(P＜0.05),而B组与C组间、A组与D组间差异无统计学意义(均P＞0.05);细胞凋亡A组高于B、C、D组,B、D组高于C组(均P＜0.05),但B、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).移植术后移植物与周围组织粘连、炎症细胞入侵,B'、C'、D'组比A'、E'组轻;移植物MHC-Ⅰ、Ⅱ分子表达,术后第1周出现高峰,同一时相B'、C'、D'组低于A'、E'组,C'、D'组低于B'组(均P＜0.05),但A'与E'组间、C'与D'组间差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:一定浓度的TG能抑制冷保存大鼠坐骨神经雪旺细胞凋亡和主要组织相容性抗原表达,降低异体移植后排斥反应.
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移植肝冷保存-再灌注过程中线粒体V复合体蛋白表达与肝细胞凋亡的关系
目的 探讨大鼠肝移植冷保存-再灌注过程中肝细胞线粒体V复合体(F0F1- ATPase)蛋白表达改变对肝细胞凋亡的影响.方法 150只Wistar大鼠,将其中144只随机等分为3组,采用改良“二袖套法”按冷保存30 min(A组)、6h(B组)、12h(C组)制作大鼠肝移植模型,剩余6只为对照组(D组).分别于制模后12、24h、3、5d采集标本.检测肝细胞线粒体F0F1 -ATPase蛋白表达、肝组织ATP含量、肝细胞凋亡计数及线粒体超微结构改变.结果 制模后12 h,C组F0F1-ATPase表达量明显低于A、B组(P＜0.05),并且线粒体超微结构损伤较重,肝细胞凋亡计数较A、B组明显增多(P＜0.05).24h后A、B、C组F0F1- ATPase表达量增加,但C组仍低于A、B组(P＜0.05).3d各组肝细胞凋亡计数无统计学差异(P＞0.05).结论 冷保存再灌注早期F0F1 - ATPase蛋白表达异常,是导致肝细胞凋亡的主要原因.
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冷保存对大鼠供肾结缔组织生长因子表达的影响
目的 探讨大鼠供肾在不同冷保存时间,其肾小管近端上皮细胞结缔组织生长因子(connective tissuegrowth factor,CTGF)的表达.方法 健康SPF级Wistar雄性大鼠40只,体重230～250 g.采取原位灌注切取整块双侧肾脏,置于0～4℃高渗枸橼酸盐嘌呤肾保存液中保存.根据保存时间不同,分为0、12、24、36、48h组(n=8).采用免疫组织化学、原位杂交方法 分别检测肾小管近端上皮细胞CTGF表达水平.结果 在0、12 h组大鼠供肾肾小管近端上皮细胞中CTGF极少表达,经图像分析两组CTGF蛋白阳性单位值(positive unit,PU)分别为5.91±2.30、5.57±2.40:CTGF mRNAPU值分别6.24±2.79、6.51±2.43,差异均无统计学意义(P>0.05).随着冷缺血时间延长,24、36、48 h组CTGF蛋白和CTGF mRNA表达均逐渐增加,24h组PU值分别为10.25±2.92、15.24±3.95;36 h组分别为14.31±2.83、19.20±4.73;48 h组分别为18.11±3.94、23.09±4.40;各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05),与0、12 h组比较差异亦均有统计学意义(P<0.05).结论 冷缺血损伤促进大鼠肾脏CTGF表达增加,可能在肾小管上皮细胞损伤再生与修复中起重要作用.
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移植肝冷保存-再灌注中肝细胞线粒体DNA ATPase8基因表达改变与细胞凋亡的研究
目的 探讨移植肝冷保存-再灌注中肝细胞线粒体DNA ATPase8基因表达改变与细胞凋亡的关系.方法 (1)Wistar大鼠186只,采用改良"二袖套法"复制大鼠肝移植模型,动物随机分为A组(冷保存30 min组),B组(冷保存6 h组),C组(冷保存12 h组)和D组(假手术对照组),分别于制模后于12 h、24 h、3 d、5 d、7 d采集标本,保证每时相点存活大鼠6只.(2)观察线粒体形态变化,检测各组大鼠肝脏SOD、ATP舍量和肝细胞凋亡数量.(3)采用RT-PCR检测mtDNA ATPase8mRNA表达.结果 冷保存-再灌注后早期(12 h),A、B、C 3组SOD、ATP含量、ATPase8mRNA表达均降低,C组显著低于A组、B组(P<0.05),并且C组肝细胞线粒体受损较重,凋亡数量明显多于A组、B组(P<0.05).再灌注24 h后A、B、C 3组SOD、ATP含量、ATPase8 mRNA表达升高,线粒体损伤减轻,肝细胞凋亡减少.结论 冷保存-再灌注后ATPase8基因表达量和ATP含量减少,细胞凋亡增多,并且冷保存时间的延长,再灌注后变化越显著,提示ATPase8基因表达异常可能是影响肝细胞凋亡的主要原因之一.
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冷保存对肝内胆管GATA因子表达的影响
目的 探讨冷保存对大鼠肝内胆管GATA因子表达的影响.方法 用酶消化辅助机械分离方法获得15只SD大鼠肝内胆管组织,将所得胆管片断培养于鼠尾胶原溶液中48 h后进行实验.将SD大鼠按照随机数字表法分为冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组,每组5只.采用Real-Time PCR和Western blot检测GATA因子的mRNA和蛋白表达水平.正态分布的计量资料采用(x)±s表示.3组比较采用方差分析,两两比较采用LSD检验.结果 对照组胆管表达GATA3、GATA4、GATA6 mRNA,不表达GATA1、GATA2、GATA5 mRNA.冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组GATA4 mRNA的表达水平分别为0.72±0.08、0.56±0.07和0.96±0.06,3组比较,差异有统计学意义(F=38.981,P＜0.05).冷保存12 h组GATA4 mRNA的表达水平显著低于冷保存1h组和对照组(P＜0.05),冷保存1h组GATA4 mRNA的表达水平显著低于对照组(P＜0.05).冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组GATA6 mRNA的表达水平分别为0.83±0.07、0.68±0.12和0.98 ±0.12,3组比较,差异有统计学意义(F=10.175,P＜0.05).冷保存12 h组GATA6 mRNA的表达水平显著低于冷保存1h组和对照组(P＜0.05),冷保存1h组GATA6 mRNA的表达水平显著低于对照组(P＜0.05).冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组GATA3 mRNA的表达水平变化不明显,分别为0.92±0.06、0.89±0.05和0.98±0.11,3组比较,差异无统计学意义(F=1.674,P＞0.05).冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组GATA4蛋白的表达水平分别为0.78 ±0.07、0.64±0.06和0.99±0.10,3组比较,差异有统计学意义(F =24.211,P＜0.05).冷保存12 h组GATA4蛋白的表达水平显著低于冷保存1h组和对照组(P＜0.05),冷保存1h组GATA4蛋白的表达水平显著低于对照组(P＜0.05).冷保存1h组、冷保存12 h组和对照组GATA6蛋白的表达水平分别为0.90±0.04、0.75±0.06和0.98±0.11,3组比较,差异有统计学意义(F=11.651,P＜0.05).冷保存12 h组GATA6蛋白的表达水平显著低于冷保存1h组和对照组(P＜0.05).结论 长时间冷保存后大鼠肝内胆管GATA4和GATA6的表达显著降低,提示GATA4和GATA6参与了冷保存后胆管的病理生理改变过程.
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冷保存后肝内胆管跨膜型黏蛋白的表达情况
目的 探讨冷保存后体外培养的SD大鼠肝内不同节段胆管跨膜型黏蛋白Muc1、Muc3A、Muc4的表达情况.方法 用酶消化辅助机械分离方法获得SD大鼠肝内胆管组织,以非吻合口狭窄好发部位为界分为大、小胆管.胆管片段在鼠尾胶原内培养48 h后进行实验.实验分为对照组、冷保存1 h组、冷保存12 h组.采用RT-PCR和Western blot法检测黏蛋白Muc1、Muc3A、Muc4的表达情况.3组比较采用方差分析,两两比较采用LSD法检验.结果 大、小胆管均表达黏蛋白Muc1、Muc3A、Muc4.随着冷保存时间延长,大胆管Muc1、Muc3A、Muc4 mRNA显著降低,冷保存1 h组分别为0.95±0.14、0.26±0.04、0.24±0.06,冷保存12 h组分别为0.18±0.03、0.14±0.04、0.22±0.07,对照组分别为1.00±0.20、1.00±0.09、1.00±0.21,3组比较差异有统计学意义(F=8.8,57.1,10.8,P＜0.05).冷保存12 h组Muc1和Muc3A mRNA显著低于冷保存1 h组(P＜0.05).大胆管Muc1、Muc4蛋白表达水平亦随冷保存时间延长而降低,对照组分别为1.05±0.41、1.06±0.38,冷保存1 h组分别为0.82±0.13、0.73±0.10,冷保存12 h组分别为0.56±0.11、0.33±0.04,3组比较差异有统计学意义(F=3.9,12.6,P＜0.05).冷保存12 h组Muc1蛋白显著低于对照组(P＜0.05).冷保存12 h组Muc4蛋白显著低于冷保存1 h组(P＜0.05).而小胆管Muc3A mRNA呈升高趋势,对照组为0.06±0.03,冷保存1 h组为0.15±0.04,冷保存12 h组为0.19±0.05,与大胆管不同.结论 长时间冷保存后肝内非吻合口狭窄好发部位胆管黏蛋白Muc1、Muc3A、Muc4表达显著降低,减弱了其对胆管上皮细胞的保护作用,可加重胆管损伤.
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不同冷保存时间的热缺血供肝在肝移植中的疗效
目的 探讨不同冷保存时间的热缺血供肝在肝移植中的疗效.方法 回顾性分析2006年1月至2007年12月中山大学附属第一医院收治的154例肝移植受者采用热缺血时间≤10 min的无心跳供者肝脏进行肝移植的疗效.根据冷保存时间将患者分为3组:<8 h为Ⅰ组,58例;8～12 h为Ⅱ组,62例;>12 h为Ⅲ组,34例.采用方差分析、t检验和X~2检验分析3组肝移植术后ALT峰值、并发症、移植肝存活和受者生存情况的差异.结果 3组受者术后均未发生原发性移植肝无功能.随访时间8～32个月,Ⅰ组受者的ALT峰值、感染发生率、胆道并发症发生率、移植肝存活率和生存率分别为(482±357)U/L、12%(7/58)、12%(7/58)、86%(50/58)和88%(51/58),Ⅲ组受者分别为(1274±608)U/L、29%(10/34)、26%(9/34)、68%(23/34)和71%(24/34),两组比较差异有统计学意义(t=5.X~2=4.28,6.77,4.51,4.28,P<0.05);而Ⅱ组受者仅ALT峰值达到(953±424)U/L,与Ⅰ组比较差异有统计学意义(t=4.76,P<0.05).结论 热缺血时间≤10 min的供肝能够耐受12 h的冷保存损伤,超过此时限,移植术后胆道并发症和感染的发生率显著升高,移植肝存活率和受者生存率显著降低.
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冷保存对大鼠部分移植肝再生的影响
目的 探讨冷保存对大鼠部分肝移植术后肝再生的影响.方法 健康SD大鼠分为Ⅰ组(肝切除组)、Ⅱ组(冷保存1 h部分肝移植组)和Ⅲ组(冷保存8 h部分肝移植组).观察各实验组生存率,比较各组术后1、6、12、24、48、72、168 h肝质量/体质量比率、肝再生率、有丝分裂指数及增殖细胞核抗原表达.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组7 d存活率分别为100%、90%、40%;Ⅲ组术后2～3 d大鼠肝质量/体质量比率、肝再生率、有丝分裂指数较Ⅰ、Ⅱ组明显偏低(P＜0.05);Ⅲ组术后12 h内增殖细胞核抗原表达较其余两组明显偏低(P＜0.05),48 h才达高峰,至第7天阳性表达仍处高水平.结论 长时间冷保存降低了部分肝移植术后的肝再生能力和大鼠术后生存率.
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雷帕霉素抑制大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖作用的研究
目的 探讨雷帕霉素对大鼠移植肝胆管上皮细胞增殖及其周围成纤维细胞活化的抑制作用.方法 "二袖套法"建立大鼠原位肝移植模型,并随机分为供肝冷保存1 h组、12 h组、雷帕霉素组(冷保存12 h组术后给予雷帕霉素)、对照组.分别于术后1、3、7、14 d检测血清ALT、TB、ALP,免疫组化法检测各组胆管上皮细胞增殖率及肌纤维母细胞分布,并统计各组生存率.结果 冷保存12 h组术后生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4),血清ALT＞200 IU/L、ALP＞160 IU/L、TB＞3.6 μmol/L,持续高于冷保存1 h组(ALT＜160 IU/L、ALP＜200 IU/L、TB＜3.6 μmol/L),各时相点胆管上皮细胞增殖率(7%,27.8%,23.1%,17.8%)显著高于冷保存1 h组(2%,6%,2.6%,2.3%)和对照组(1.3%).冷保存12 h组术后7、14 d可见胆管周围较多肌纤维母细胞聚集;雷帕霉素组术后2周生存率与冷保存12 h组接近(P=0.89),胆管上皮细胞增殖率(5.9%,15.8%,13.6%,11.4%)明显降低,胆管周围肌纤维母细胞分布较少.结论 冷保存-再灌注直接损伤肝脏,诱导胆管上皮细胞增殖及肌纤维母细胞聚集,雷帕霉素明显抑制胆管上皮细胞增殖及肌纤维母细胞活化并对移植肝具有保护作用.
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供肝热缺血后对冷保存的耐受时限初步探讨
目的探讨供肝热缺血后耐受冷保存的安全时限.方法利用本组所建立的小型猪肝移植模型,设定供肝热缺血时间为20 min,根据在UW液中的冷保存时间不同分为3组,分别冷保存12、16、20 h,于肝移植术中及术后检测肝功能、肝脏病理、肝组织ATP含量、移植肝脏再灌注后微循环血流量及动物术后1周存活率.结果UW液冷保存12 h组肝移植后小型猪1周内全部存活,而冷保存16、20 h组存活率分别为20%、0%;随着冷保存时间的从12 h延长到20 h,ALT、AST逐渐上升,肝脏ATP含量、肝脏微循环血流量逐渐下降,形态学结果显示肝组织细胞变性、坏死及超微结构损害的程度逐渐加重.冷保存12 h组与后两组上述指标存在显著性差异,生化及肝脏微循环指标的改变与病理结果及动物生存率相符合.结论在本实验条件下,热缺血时间为20 min的供肝耐受冷保存的安全时限约为12 h.
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冷保存大鼠部分肝移植模型的建立
目的建立稳定的大鼠部分肝移植模型,研究冷保存对部分肝移植后肝再生的影响.方法采用雄性SD大鼠,双袖套法行部分肝移植,观察不同冷保存时间受体生存状况以及各组手术情况.结果各组移植肝平均体积为62%-64%,无肝期为14-15 min.长时间冷保存后大鼠7 d存活率明显下降,生存分析显示各组问差异有显著性.8 h冷保存后大鼠7 d存活率为40%,与临床辟裂式肝移植1年生存率相似.结论8 h保存大鼠部分肝移植模型是研究冷保存对部分肝移植肝再生影响的较好模型.
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不同胆道灌洗方法对供肝胆道冷保存损伤的影响
目的探讨不同胆道灌洗方法对供肝胆道冷保存的影响.方法将经历相同热缺血时间的SD大鼠肝脏用4℃UW液(solution of university of siscolnsin)门静脉灌注后,分为胆道非灌洗组、4℃生理盐水灌洗组、4℃UW液灌洗组、4℃生理盐水+UW液灌洗组,分别置于4℃UW液中保存,光镜观察胆道粘膜.结果非灌洗组胆道损伤明显,生理盐水组存在一定程度的胆道损伤,4℃生理盐水+UW液组胆道保护效果理想,4℃UW液逆行灌洗组次之.结论①肝脏冷保存前必须进行胆道灌洗,避免残留胆汁对胆道损伤;②冷保存前胆道灌洗可以明显减轻胆道损伤;③不同胆道灌洗方法中采用4℃生理盐水灌洗+UW液灌注保存效果理想.
