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肝窦内皮细胞的冷保存损伤对肝移植的影响
肝移植的发展推动了肝外科的发展,扩大了肝外科的领域,并在许多肝病的治疗作用上已经得到了医学界的肯定,被认为是治疗终末期肝病的有效的方法.迄今为止,全世界已累计实施超过11万例次肝移植,我国统计自1993年1月1日～2011年2月16日,中同肝移植登记例数19 643例,挽救了众多终末期肝病患者的生命[1].但是目前,由于我国尚未建立"脑死亡法",伦理道德观与两方国家有巨大差异,缺乏正常渠道的供肝成为制约我国肝移植发展的突出问题.
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冷保存再灌注期间离体肝组织内氧自由基及[Ca2+]i对p38MAPK激活的影响
目的:了解离体肝脏缺血再灌注期间氧自由基及钙离子超载是否是激活p38MAPK的因素之一,为进一步揭示肝脏缺血再灌注损伤的信号转导机制打下基础.方法:通过自行建立的兔离体肝脏缺血再灌注模型,根据冷保存液中别嘌呤醇浓度的不同分为A、B、C、D 4组;根据冷保存液中维拉帕米浓度的不同又分为E、F、G、H4组;分别于离体前、冷保存末及再灌注5 min、10 min、60 min、120 min获取离体肝组织,分别应用免疫映迹杂交(western-blot)和免疫沉淀法测定磷酸化p38MAPK的表达及活性水平;并进行肝组织内氧自由基(oxygenfree radicals,OFR)含量的测定(A、B、C、D组);用Fura-2/AM负载法进行肝细胞内钙离子浓度测定(A、E、F、G组).结果:于再灌注5 min各组离体肝组织的氧自由基水平升高至峰值,但各组两两之间存在显著性差异(A、B、C、D组:2.32±0.22,1.82±0.15,1.63±0.11,1.29±0.10,P＜0.05,t=2.57);于再灌注10 min供肝组织p38MAPK磷酸化水平及活性均升高至峰值,但各组两两之间存在显著性差异(A、B、C、D组p38MAPK磷酸化水平:76.2±7.0,61.4±5.9,47.3±2.5,37.7±3.0,P＜0.05,t=.61;A、B、C、D组p38MAPK活性水平:82.7±6.8,69.7±5.2,54.5±5.5,41.2±3.1,P＜0.05,t=2.61;A、E、F、G组p38MAPK磷酸化水平:80.3±8.7,63.3±4.2,50.4±5.6,39.2±5.7,P＜0.05,t=2.61;A、E、F、G组p38MAPK活性水平:80.8±8.9,66.7±4.2,53.7±4.1,39.4±5.5,P＜0.05,t=2.61);再灌注5 min时氧自由基及[Ca2+]j越高的离体肝,则再灌注10 min时离体肝组织p38活性峰值越高,二者之间呈显著性相关关系.(P<0.05,ROFR=0.976,RCa=0.970)结论:别嘌呤醇能显著性抑制离体肝缺血再灌注期间肝组织内OFR水平,而维拉帕米能显著性抑制离体肝缺血再灌注期间肝细胞内钙离子浓度超载;而且OFR水平及钙离子与离体肝组织p38MAPK的激活密切相关.
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丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用
目的:探讨丙酮酸(pyruvate)对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤的保护作用及其机制.方法:建立大鼠小肠移植缺血再灌注损伤的动物模型,实验组和对照组分别经肠腔给予含有丙酮酸钠和等能量的多聚葡萄糖营养液,对不同冷保存缺血、再灌注时间的小肠进行组织病理学观察并利用酶联免疫法检测肠黏膜中的TNF-α和IL-6水平.结果:丙酮酸处理后的小肠组织损伤较对照组明显减轻,小肠黏膜中TNF-α和IL-6水平减低.结论:丙酮酸对大鼠移植小肠缺血再灌注损伤具有保护作用;该保护作用与丙酮酸减少小肠组织中的TNF-α和IL-6水平有关.
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冷保存、慢性排斥反应构建移植肝胆管病大鼠模型
目的 建立大鼠移植肝胆管病模型并评估其意义.方法 将大鼠按实验要求分为4组:(1)长时间(12 h)冷保存组(n=24):同基因系近交系大鼠♂Wistar→♂Wistar,所获供肝于4℃UW液保存12 h后行两袖套法大鼠原位肝移植(rat liver orthotopic transplantation,ROLT).术中利用内支架管直接对合供、受体肝总动脉及肝外胆管；(2)慢性排斥反应组(低剂量环孢素每天1 mg/kg,冷缺血时间1 h)(n=24):异基因近交系大鼠♂DA→♂Lewis.供肝于4℃UW液保存1h后同法行ROLT; (3)对照组(冷保存时间1 h)(n=24):同基因系近交系大鼠♂Wistar→♂Wistar,供肝于4℃UW液保存1h后同法行ROLT; (4)假手术组(n=24):♂Wistar大鼠,只进行开关腹手术.观察术后16周内各组大鼠并发症的发生情况和大鼠肝脏标本的病理学改变.结果 在长时间冷保存组和慢性排斥反应组,术后大鼠意识恢复慢,胆道及血管并发症发生率高,肝内汇管区胆管增生及炎细胞浸润明显.16周时可见肝小叶被增生胆管分隔,正常肝小叶结构消失,增生胆管上皮细胞萎缩、坏死、胞浆消失,仅见固缩的细胞核.胆管周围有较多的炎细胞浸润,肝内小动脉闭塞或消失.结论 通过供肝长时间冷保存或诱导慢性排斥反应可以建立稳定可靠的大鼠移植肝胆管病模型.该模型是研究肝移植术后移植肝胆管病的理想模型.
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常温机械灌注减轻猪心脏死亡供肝胆管损伤
目的 探讨常温机械灌注对猪心脏死亡器官捐献(DCD)供肝胆管保存的保护作用.方法 12例热缺血40 min的猪DCD供肝随机分为实验组和对照组,每组6个.实验组常温机械灌注(NMP)6 h,并监测灌注期间肝动脉及门脉灌注压力、流量的变化,测量灌注液内ALT、AST等水平,记录每小时胆汁分泌量.对照组UW液冷保存6 h(0 ～4℃).保存结束时,取两组胆管标本行病理学检查.结果 实验组保存期间,动脉及门脉流量始终稳定.灌洗液内ALT、AST水平在灌注开始后,有较高水平的上升,之后维持稳定水平.保存期间胆汁分泌量逐渐增多,第3h达到高峰,6h产生胆汁总量为(27.6±0.6)ml.HE染色可见对照组胆管上皮细胞表面黏膜脱落,部分小胆管坏死,炎细胞浸润,偶见小动脉坏死,血管内皮细胞有不同程度水肿、剥脱,伴出血及小血管透明血栓形成;实验组仅有少量炎细胞浸润,偶见内皮细胞水肿,伴出血.两组胆管组织半定量评分[(12、10、9、8、7、10)比(6、8、7、7、5、9)]差异有统计学意义(P＜0.05).结论 常温机械灌注是一种有效的供体器官保存方法.该法不但可通过持续提供氧及营养代谢底物恢复DCD供肝能量储备,从而逆转热缺血过程中ATP供应中断引起的损伤;还可避免器官保存过程中的进一步损伤,对DCD供肝以及胆管有很好的保护作用.
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HIF-1α表达对移植肝脏肝窦内皮细胞的影响
移植肝冷保存引起肝窦内皮细胞(sirius endothelial cell,SEC)选择性损伤,提高肝脏尤其是SEC的抗缺血缺氧能力一直是肝移植外科关注的问题[1].
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热缺血供肝耐受冷保存的时限研究
有研究表明,热缺血30 min以内的供肝可考虑加以利用[1,2],本实验旨在探讨热缺血已达30 min的供肝在UW液中冷保存的安全时限.
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移植肝冷保存/再灌注胆管损伤的机制
肝移植术后胆道的生理及病理变化一直是众所关注的课题.胆道并发症是影响肝移植受者术后生活质量、导致移植物丧失甚至病人死亡的重要因素[1],总体发生率为5.8%～40.0%[2,3],而对于某些特殊类型的肝移植,如活体右半肝移植的胆道并发症发生率可高达15%～64%[4],儿童肝移植胆道并发症的发生率也明显为高[5].近年来,随着移植技术的进步和新型免疫抑制剂的使用,受者及移植物的短期存活率有了显著提高,但长期生存率依然没有明显的改善,而胆道并发症被认为是导致这一结果的主要原因之一.
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肝胆转运系统在肝移植术后胆汁排泌功能障碍中的作用
肝移植是治疗终末期肝胆疾病的有效手段,但术后淤胆和胆管并发症仍是棘手问题.肝胆转运系统在胆盐、磷脂和胆固醇等分泌和排出中起关键作用,但肝移植中的缺血冷保存及免疫反应等不可避免地造成肝细胞、胆管细胞及其转运蛋白的功能障碍,影响术后的胆汁排泌.
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冷保存的同种异体动脉移植物在活体肝移植中的应用
活体肝移植(living donor liver transplantation,LDLTX)是目前解决供肝短缺矛盾的有效方法之一.LDLTX术中为保证移植肝有良好的静脉流出道,许多情况下需用血管移植物重建移植肝的部分肝段静脉;20世纪70至80年代就有同种异体动脉移植物在肝移植中使用的报道,主要用于尸体供肝的动脉重建,随后血管移植物越来越多地用于肝移植的血管重建,同时也有相应的研究报道[1-4].我中心在一部分活体肝移植的肝静脉重建中采用了冷藏保存的同种异体动脉移植物,现将临床研究结果报告如下.
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透明质酸在肝移植中的应用
到目前为止,人们尚没有建立一个非常满意的预测供肝质量的标准,即供肝冷保存后,在即将植之前,如何较准确地判断它的功能以及植入后它能否成活.80年代中后期,透明质酸(hyaluronic acid,HA)用于各种肝病的研究,进入90年代,它在肝移植领域中受到关注.下面就其生化、功能及近年来在肝移植中的应用作一综述.
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二氮嗪对低温保存诱导的心肌线粒体氧自由基的清除作用
目的 观察二氮嗪(diazoxide,DE)对不同时程低温保存诱导产生的大鼠心肌细胞线粒体内氧自由基的清除作用.方法 根据不同的低温保存时程,SD大鼠随机分9组,每组8只.利用Langendorff离体鼠心灌注法停搏大鼠心脏,然后在4℃单纯Celsior保存液或加入DE(30 μmol/L)的Celsior保存液中分别保存0h、3h、6h、9h或12h后,检测心肌细胞线粒体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性和丙二醛(maleic dialdehyde,MDA)含量的变化.且同步观察电镜下心肌超微结构的变化.结果 ①与对照组比较,随着冷保存时间的延长,心肌细胞线粒体内SOD活性随之降低,MDA含量随之升高,电镜结果显示心肌细胞线粒体超微结构随之破坏加剧;②与相应低温保存时程的单纯celsior液组比较,在保存液中加入DE后,上述各项指标均有明显改善,且以冷保存6h和9h后为显著.结论 DE在大鼠心脏长时程低温保存期间町通过直接清除自由基及提高线粒体SOD活力而减轻由长时程低温保存导致的心肌细胞线粒体的损伤.
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幼猪小肠冷保存再灌注模型制作的麻醉和围手术期处理
小肠冷缺血再灌注模型制作是研究小肠保存的主要技术.通常采用离体小肠灌注冷保存、原位或异位移植.我们对传统方法进行改进,成功建立了在体小肠冷缺血再灌注模型.现介绍模型制作的麻醉方法和围术期处理.
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川芎嗪预处理促进大鼠坐骨神经异体移植后神经再生实验研究
目的 探讨用川芎嗪预处理冷保存的大鼠坐骨神经修复周围神经缺损的可行性.方法 40只Wistar大鼠和40只SD大鼠分别为供体和受体,取供体双侧坐骨神经长15mm,随机在川芎嗪溶液(0、50、100、200 mg/L,A、B、C、D组,n=20)中4℃冷保存6周,透射电镜观察坐骨神经超微结构,Calcein-AM荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)观察;受体大鼠随机分为A '、B '、C'、D'组(n=10,对应A、B、C、D组),用冷保存6周的供体神经修复对应组受体坐骨神经10mm缺损.术后分期行大体观察,检测坐骨神经功能指数(SFI),术后20周行电生理检测、再生神经图像分析和透射电镜观察.结果 大鼠坐骨神经冷保存6周,A组神经纤维严重脱髓鞘变化和轴索萎缩变性、蜂窝状改变,而B、C、D组变化较轻;LSCM结果显示,B、C、D组荧光强度高于A组,B组高于C、D组,差异均有统计学意义(P＜0.05),C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).术后动物存活至实验结束,各期SFI,20周电生理检测,再生有髓神经纤维数目、髓鞘厚度,B'、C '、D'组与A'组比较,B'组与C'、D'组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),C'、D '组间差异无统计学意义(P＞0.05);术后20周透射电镜观察显示,A'组再生有髓神经纤维少、髓鞘薄,结缔组织增生明显,B'、C'、D '组有髓神经纤维较多、髓鞘较厚,结缔组织增生不明显.结论 一定质量浓度的川芎嗪对冷保存大鼠坐骨神经具有保护作用,并能促进异体移植后神经的再生.
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冷保存方法构建的大鼠肝移植模型
背景:肝移植是终末期肝病为有效的治疗手段,移植后胆病是制约肝移植发展的主要障碍之一.目的:建立稳定的大鼠冷保存肝移植模型,探讨冷保存对肝移植后肝脏胆管的影响.方法:120只雄性SD大鼠随机分为4组,按照组内随机配对的原则,体质量相对较轻的大鼠做为供体,供肝置于4℃ UW液中分别保存2,8,16 h后行原位肝移植.在"两套袖法"基础上,以"支架法"建立动脉化大鼠原位肝移植模型,供受体肝总动脉采用改良"支架法"进行端端吻合,重建肝动脉血供.记录移植手术时间及移植成功率,并分别于移植后3,7 d检测血清转氨酶、总胆红素、碱性磷酸酶水平,同时观察组织病理学改变.结果与结论:实验共完成55例次大鼠原位肝移植手术,手术成功率为93%.冷保存2,8,16 h组术后7 d存活率分别为100%(9/9),83%(10/12),73%(8/11).随着冷保存时间的延长,肝功能及肝内胆管损伤加重,胆管组织病理学评分显示各组间差异有显著性意义(P<0.05).其中供肝冷保存16 h大鼠肝移植模型既有较高的手术存活率又有严重的胆管损伤,是研究冷保存对肝移植胆管病影响的较好模型.
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冷保存-再灌注损伤对大鼠移植肝胆管上皮细胞凋亡及bcl-2/bax表达的影响
背景:移植肝胆管上皮细胞凋亡是影响肝移植后胆道功能恢复的因素之一,调控基因bcl-2/bax可能对胆管上皮细胞的生存起到决定作用.目的:观察缺血-再灌注损伤后大鼠肝内胆管上皮细胞的凋亡及调控基因bcl-21bax mRNA表达的变化.设计、时间及地点:动物实验,细胞形态学观察,于2008-02/08在解放军第三军医大学西南医院肝胆外科研究所实验室完成.材料:健康雄性Wistar大鼠100只,随机分为3组:供肝冷保存1 h组40只,冷保存12 h组40只,对照组20只.方法:供肝冷保存1,12 h组,组内随机配对,体质量相对较轻的大鼠做为供体,供肝置于4℃器官保存液中,分别保存1、12 h后行原位肝移植,对照组只行开、关腹手术.在"两套袖法"基础上,以"支架法"建立动脉化大鼠原位肝移植模型,供受体肝总动脉采用改良"支架法"进行端端吻合,重建肝动脉血供.主要观察指标:分别于移植后1,3,7,14 d检测血清总胆红素、碱性磷酸酶及肝内胆管上皮细胞的凋亡,实时荧光定量RT-PCR法检测胆管上皮细胞内bcl-2 mRNA和bax mRNA的表达.结果:保存1 h组移植后1,3 d可见轻度胆道损伤的血清学及病理学表现,肝内胆管上皮细胞凋亡指数分别为(4.6±0.23)%,(3.42±0.22)%,(2.91±0.23)%,(2.87±0.16)%,且在移植后7 d即与对照组无明显差异.在保存12 h组移植后1,3,7 d,胆汁郁积征象明显,伴有严重的胆管损伤病理学改变,且肝内胆管上皮细胞凋亡指数明显高于保存1h组和对照组,分别为(6.51±0.33)%,(8.52±0.36)%,(3.51±0.27)%,(2.91±0.28)%.在移植后各时相点,保存1h组肝内胆管上皮细胞内bcl-2mRNAlbaxmRNA比值分别为(1.12±0.12)%,(1.34±0.13)%,(1.51±0.14)%,(1.60±0.15)%,在移植后7 d即接近对照组水平,而保存12h组则为(0.90±0.08)%.(0.79±0.02)%,(1.36±0.12)%,(1.59±0.14)%,在移植后7d仍明显低于保存1 h组和对照组,且与肝内胆管上皮细胞凋亡指数显著负相关(P=0.029).结论:冷保存时间延长导致胆道功能严重损伤,导致肝内胆管上皮细胞内bcl-2 mRNNA/bax mRNA下调,促进移植后早期肝内胆管上皮细胞的凋亡.
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不同冷保存时间热缺血供肝在肝移植中的应用
背景:目前国内临床肝移植供肝的主要来源仍然是无心跳供体供肝,国外近年来也越来越多地使用无心跳供体供肝,但无心跳供体供肝这类经历了热缺血的供肝能够耐受冷保存的安全时限尚没有统一标准,也鲜有这方面的临床报道.目的:评价不同冷保存时间的热缺血供肝在临床肝移植中的应用安全性及疗效.设计、时间及地点:随机对照观察,于2006-01/2007-12在中山大学附属第一医院器官移植中心完成.对象:无心跳供体供肝热缺血时间在10 min内的肝移植病例154例.方法:根据冷保存时间不同分为3组,8 h内组58例,8～2 h组62例,13～16 h组34例.供肝按供体分配原则按随机数字表法分配给3组患者,移植后采用相同的免疫抑制方案.主要观察指标:比较3组患者肝移植后谷丙转氨酶峰值、原发性移植肝无功能、急性排斥反应、胆道并发症、血管并发症、感染,以及移植肝存活和受体存活情况的差异.结果:随访8～32个月,3组患者移植后均未发生原发性移植肝无功能.8～12 h组患者移植后仅谷丙转氨酶峰值高于8 h内组(P＜0.05),其余治疗两组比较差异均无显著性意义(P＞0.05).与8 h内组患者比较,13～16 h组患者的移植后谷丙转氨酶峰值、感染发生率和胆道并发症发生率显著升高(P＜0.05),移植肝存活率和受体存活率显著降低(P＜0.05).结论:热缺血时间在10 min内的无心跳供体供肝能够耐受12 h的冷保存损伤,超过此时限,移植后胆道并发症和感染的发生率明显升高,移植肝存活率和受体存活率明显降低.
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低温机械灌注与单纯冷保存供肾对肾移植预后影响的Meta分析
背景：目前，国内外低温机械灌注与冷保存对肾移植预后影响的文章比较多，但结论各异，且由于大多单个研究样本量存在局限，对低温机械灌注的优缺点缺乏客观评价。目的：比较低温机械灌注与冷保存对肾移植预后的影响。方法：计算机检索PubMed、sinoMed、EMbase、Web of Science、the Cochrane Central Register of Controled Trials (CENTRAL)、万方数据库及中国知网，查找并筛选出所有比较低温机械灌注与冷保存对肾移植预后影响的随机对照试验(Randomized Controled Trial，RCT)，同时手检纳入文献的参考文献，检索时限均为建库至2015年3月4日。按纳入排除标准由2位评价者独立进行RCT的筛选、资料提取和质量评价后，采用RevMan(5.3.0版)软件进行Meta分析，并采用GRADEpro3.6软件进行证据质量评价。结果与结论：共纳入文献6篇，低温机械灌注保存供肾共619例，冷保存保存供肾共620例。结果显示：低温机械灌注组原发性移植物无功能发生率、功能性移植肾功能延迟恢复发生率、移植肾功能延迟恢复发生率均显著低于冷保存组(P <0.05或0.01)。患者1年生存率、移植物1年存活率差异均无显著性意义(P >0.05)。结果表明低温机械灌注保存供体只能降低肾移植后近期并发症的发生率，维护肾脏功能，但无法提高患者1年生存率和移植物1年存活率，相比较冷保存的保存方式，低温机械灌注对供体器官的保护无长期优势。
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冷保存鼠肝脏肝细胞线粒体的分离
在临床肝移植实践中,冷保存损伤是影响肝移植成功的主要因素之一.此过程中线粒体结构和功能的变化是保存损伤的特征之一,因此在研究中采用一种有效的线粒体分离方法也尤为重要,本实验应用改进差速离心法分离冷保存1,2,3,4 h肝脏肝细胞线粒体,评价此法适用条件.1 材料与方法1.1 材料动物及分组:Wistar大鼠20只,8周龄,雄性0.2～0.25kg,购自中国医科大学实验动物中心,按随机数目表法将大鼠分为4组,每组5只. 剂试与仪器:25%戊二醛,Sigma公司.A液为0.9%氯化钠溶液,B液为0.25 mol/L蔗糖-1 mmol/LEDTA溶液,pH7.6.85 p-72型低温冷冻离心机,LKB-V超薄切片机,HE-600电子显微镜,日立公司.
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术前营养状态影响原位肝移植存活率的实验研究
大鼠原位肝移植是冷保存、缺血再灌注以及移植排斥等多项肝移植基础研究的重要模型手段.然而营养状态对供肝造成的内在影响,并由此是否会影响术后存活率,在国内尚无研究报道.
