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表达人冠状病毒NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒的制备与表达分析
HCoV-NL63是新近发现的人冠状病毒,对其外膜糖蛋白-棘突蛋白的表达及功能的研究仍有待深入.本研究利用天坛株痘苗病毒载体,克隆构建可表达HCoV-NL63棘突蛋白四个片段(N端棘突蛋白:S1;C端棘突蛋白:S2;受体结合区大片段:RL;受体结合区小片段:RS)的重组痘苗病毒(vJSC1175-S1;vJSC1175-S2;vJSC1175-RL;vJSC1175-RS),酶切测序证实表达载体构建正确,免疫荧光分析(IFA)各重组痘苗病毒中棘突蛋白不同片段的表达与定位,western-Blot分析表明各种重组蛋白表达正确.分析结果显示:4种重组蛋白均能有效表达,S1、RL及RS蛋白的荧光主要分布在细胞膜上,而S2蛋白的荧光则主要分布于细胞浆,各个片段的分子量大小与文献报道相同,并可进行正确的翻译修饰(糖基化).本研究首次采用痘苗病毒天坛株载体构建制备了表达HCoV-NL63棘突蛋白不同片段的重组痘苗病毒,为进一步分析人冠状病毒HCoVNL63棘突蛋白的结构功能及探索其抗原性和免疫原性奠定了基础.
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SARS冠状病毒S蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化
导致严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的元凶是一种新型的冠状病毒(SARS coronavirus,SARS-CoV).SARS-CoV感染入侵宿主细胞关键的一环是病毒自身的棘突蛋白(spike protein,S protein)与细胞受体的相互作用,故而S蛋白已成为SARS研究的主要热点.本文通过构建杆状病毒载体,利用昆虫细胞表达体系,在真核细胞中得到了全长S蛋白,并用恢复期SARS患者的血清对其进行了初步鉴定.这为进一步深入研究SARS-CoV S蛋白与宿主细胞的作用机制、研发SARS疫苗等提供了实验材料.
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棘突蛋白在冠状病毒跨宿主感染中的作用
冠状病毒感染有相对严格的宿主和组织特异性,其中部分病毒在演化中会发生细胞嗜性改变.冠状病毒的跨宿主感染能力主要取决于病毒表面棘突蛋白的变异及其与受体相互作用的特异性改变.棘突蛋白的变异主要集中在受体结合域(RBD),其他区域也与病毒感染的宿主细胞特异性有关.另外,较大的RNA基因组、独特的套氏亚基因组转录、复制过程中模板转换引起的高频率基因重组等使冠状病毒不断出现毒力或宿主变异,而共感染和持续性感染则为病毒重组及跨宿主感染提供了机会.
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SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究
目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答.方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒.并通过Lipofectamine 2000 将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达.以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布.结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达.免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200.pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3.脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD+3和CD+8T细胞明显升高.结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答.
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SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究
目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答.方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒.并通过Lipofectamine 2000 将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达.以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布.结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达.免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200.pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3.脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD+3和CD+8T细胞明显升高.结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答.
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SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达
构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序.用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌JM109,PCR和双酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达.RT-PCR扩增出S2特异片段,经测序与GenBank比对存在1处碱基突变.S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒,并在JM109中表达了S2融合蛋白.成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白.
