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抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究
通过 Western blot、体外捕获PCR、ELISA阻断实验及合成的多肽库等方法,对23株抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆抗体(单抗)识别HEV ORF2表位的作用进行系统研究.结果显示,7株线性单抗识别表位都位于ORF2aa408～458之间,16株构象型单抗识别表位都定位于ORF2 aa459～606之间,大部分构象型单抗识别表位都在天然病毒表面.对这些单抗识别表位系统地了解将为HEV疫苗、诊断、病毒受体和病毒感染机制等方面的研究提供重要工具.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 单克隆抗体(单抗 McAb) 表位 -
新疆奶牛戊型肝炎病毒RNA检测及序列分析
从新疆两个奶牛场的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体检测阳性的奶牛中分别采集牛粪便或肛拭子样品,利用反转录套式聚合酶链反应(RT-nPCR)检测所采集样品中的HEV RNA,结果来自第一个奶牛场的7份牛粪便样品为阳性,阳性率11.67%,来自第二奶牛场的1份肛拭子样品为阳性,阳性率为3.23%.将PCR扩增产物克隆、测序并进行序列分析,结果表明,对应于HEV ORF2 189bp核苷酸序列的8个牛源HEV基因组扩增片段的同源性为96.3%～100.0%,应当属于相同的基因型;它们与HEV 1、2、3和4型ORF2 189bp核苷酸平均同源性分别为78.5%～86.4%,81.7%～83.8%,79.1%～85.3%和84.3%～95.8%,与4型的同源性高达93.2%～95.8%.基于这些已测序核酸片段绘制的基因进化树显示:本研究中的8株牛源HEV ORF2 189bp核苷酸序列与HEV 4型人源C5株、猪源swC3与swXJ株位于同一进化枝上,同属HEV基因4型,提示新疆奶牛中可能存在HEV感染,并且奶牛可能是人类HEV传染源中除猪之外的新宿主.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 反转录套式聚合酶链式反应 奶牛 -
携带EGFP基因的戊型肝炎病毒重组质粒的构建及其感染性的验证
为了构建携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组质粒,转染人肺癌细胞A549细胞验证其感染性,PCR法分两段扩增HEV全基因组序列和EGFP基因序列,将EGFP报告基因插入到HEV ORF2基因下游,并克隆到体外转录表达载体pGEM(@)-7Zf(+)上.然后利用脂质体转染法将重组质粒转入A549细胞,24 h后在荧光显微镜下观察EGFP的表达;转染72 h后,利用免疫荧光法检测HEV ORF2蛋白的表达.转染7d后将发生病变的A549细胞收集作为接种物,接种A549细胞验证携带EGFP的HEV-EGFP重组病毒的感染性.结果显示经酶切和测序鉴定携带EGFP的HEV重组表达质粒pGEM-HEV-EGFP构建成功;EGFP基因与HEV在A549细胞中可融合表达;携带EGFP的HEV重组表达质粒转染A549细胞7d后出现病变,并且连续传代3代仍具有感染性.本研究成功构建了携带EGFP的HEV全基因组重组质粒pGEM-HEV-EGFP,并成功感染A549细胞,为进一步研究HEV的复制机制及致病机理奠定基础.
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HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究
利用重组戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白片段p239(368～606 aa)形成的类病毒颗粒作为亲和层析诱饵蛋白,HepG2 为细胞模型,筛选与p239类病毒颗粒特异性相互作用蛋白.经过二维电泳分离, MALDI-TOF-MS分析鉴定得到GRP78/Bip,HSP90,alpha-tubulin及P43四个与p239有相互作用的候选蛋白.GRP78/Bip为热休克蛋白家族成员,体外免疫共沉淀实验结果证实,其与p239有特异性的结合. 此研究结果为深入研究HEV的感染过程如吸附、入胞,以及HEV的致病机理提供了有益线索.
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戊型肝炎病毒高通量中和效价评价模型的建立
广泛有效的体外感染模型的缺乏限制了抗戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗体及血清定量化中和效价的评估,从而阻碍了对HEV相关抗体应答及免疫机制的深入研究.本研究首先通过在HEV低效复制细胞系HepG2肝癌细胞株上进行了HEV感染细胞后的连续监测,直到第13d到达病毒载量的检测下限,验证了该细胞系建立感染模型的可行性,进一步采用96孔多通道平行感染、核酸提取及实时荧光定量PCR对五株抗HEV的鼠源单克隆抗体及四位戊肝疫苗接种者的接种前、后血清样本进行了细胞中和试验.结果显示应用该模型能够实现对不同中和能力的单抗及接种疫苗前后的血清进行中和效价的定量化评估.表明本研究已成功建立了HEV体外高通量中和评价模型,同时也显示出该模型在HEV疫苗及抗体应答表位研究中所具有的潜在价值.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 细胞模型 评价 中和活性 高通量 -
人肝细胞内戊型肝炎病毒结合蛋白的酵母双杂交筛选
为进一步深入研究戊型肝炎病毒(HEV)感染机制以及致病机理,用酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒衣壳蛋白E2相互作用的蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,4个克隆与E2相互作用,其中一个克隆与P38IP高度同源,细胞免疫共沉淀实验结果显示:在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 结合蛋白 酵母双杂交 -
戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究
E.coli中表达的HEV衣壳蛋白片段P239(aa368～606)形成的类病毒颗粒与戊肝患者恢复期血清及中和单抗具有良好的反应性,较好地模拟了天然HEV病毒颗粒的表面空间结构.利用P239 吸附HepG2细胞的模型来模拟HEV对宿主细胞的吸附,多株中和单抗对吸附的阻断验证了吸附的特异性.P239与多株传代细胞系的吸附结果则表明了这种特异性吸附的细胞选择性.对阻断P239吸附的线性单抗进行定位,初步确定了P239与细胞相互作用的区域:ORF2上的aa423～443很可能和病毒上的细胞膜受体结合部位非常靠近,或可能直接参与构成了病毒与细胞特异性识别的表位.此本研究为进一步研究HEV与宿主细胞的相互作用提供一定的线索.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 类病毒颗粒P239 HepG2 单抗阻断 -
戊型肝炎病毒抗体检测的现状、问题与展望
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染是包括我国在内发展中国家成人急性肝炎的主要原因,在发达国家戊型肝炎的发病率也在不断升高,且在免疫抑制患者中可引起慢性感染,因此对HEV感染的诊断受到广泛重视.血清学检测,包括抗-HEV IgM和IgG,仍是诊断HEV感染的主要手段,但目前存在的大问题是检测抗-HEV抗体的试剂之间的敏感性和特异性差异很大,检测结果的符合率差.本文着重综述了国内外常用抗-HEV抗体检测试剂的组成以及检测结果,提出了今后可能有利于提高检测敏感性和特异性的研究构思.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 血清学检测 敏感性 特异性 -
重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白p239特异性吸附、侵入HepG2细胞并阻断野病毒对肝细胞的感染
戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的戊型肝炎在临床症状上与甲肝相似,但病死率更高,妊娠晚期病死率可高达15%～25%[1].近年来,戊肝在世界各地暴发不断;而我国戊肝发病迅速增长,已经成为普遍流行、危害严重的疾病之一[2].
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 病毒吸附 -
HEVAg-PLGA纳米颗粒疫苗小鼠体内免疫学研究
研究重组戊型肝炎抗原(HEVAg)-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)纳米颗粒抗原能否在动物体内诱导产生免疫应答.制备HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原后,通过皮下、滴鼻、口服途径接种Balb/c小鼠,每隔4周加强免疫两次,HEVAg与铝盐佐剂(铝佐剂疫苗Al2O3-Ag)为对照组,一定时间内检测抗体及细胞因子的应答水平.结果HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原在小鼠体内诱导产生有效的体液免疫、细胞免疫.滴鼻、口服途径黏膜系统中诱导产生较高滴度的IgA抗体,ELISPOT结果显示鼻腔、唾液腺中IgA ASCs数量显著增加;皮下途径诱导产生较高滴度的IgG抗体;常规铝佐剂疫苗相比于HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导较强的IgG抗体水平,未诱导产生黏膜免疫应答;HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原诱导产生较强细胞免疫应答,皮下接种途径IFN-γ、IL-4生成细胞数量显著高于其它免疫组.与铝佐剂疫苗相比,HEVAg-PLGA纳米颗粒抗原能有效诱导产生系统免疫及黏膜免疫应答,显示HEVAg-PLGA有潜力成为备选HEV黏膜疫苗抗原,同时展示PLGA颗粒作为黏膜系统抗原递送载体及黏膜佐剂的优越性.
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戊型肝炎病毒感染ZCLA长爪沙鼠的实验研究
目的:确定ZCLA长爪沙鼠作为戊型肝炎病毒感染动物的可能性.方法:选取鉴定含有戊型肝炎病毒的患者粪便,PBS混匀制成10%的粪悬液后10-1原液浓度腹腔接种ZCLA长爪沙鼠100μl,分别收集实验第0,7,14,21,28,35,42,49天的粪便,荧光定量PCR测定接种粪悬液以及收集的粪便所含戊型肝炎病毒滴度.结果:ZCLA长爪沙鼠腹腔接种的粪悬液所含戊型肝炎病毒滴度为4.1 × 103 copies/g,实验第7天ZCLA长爪沙鼠出现粪便排毒现象并持续至第35天,第7天粪便中戊型肝炎病毒滴度高,为1.9×103 copies/g,随着实验进程时间推移HEV滴度逐渐降低.呈现下降趋势,第42天和第49天粪便HEV检测均为阴性.对照组粪便HEV检测均为阴性.结论:ZCLA长爪沙鼠能够感染戊型肝炎病毒,可以考虑进一步应用于戊型肝炎病毒动物感染研究.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 感染 ZCLA长爪沙鼠 -
广州地区急性散发性HEV毒株基因特征和生物学性状的研究
利用RT-PCR技术对我国广州地区急性散发性戊型肝炎病毒细胞培养分离株G93-1、G93-2、G93-3和G93-4基因组聚合酶区部分核苷酸序列(4522～4761nt)进行检测,PCR阳性产物经纯化、克隆后测序.结果G93-1、G93-3和G93-4株病毒的这段序列完全相同,且与我国新疆暴发流行的HEV 87A株及亚洲HEV代表株的同源性为100%;而G93-2株与它们的差异较大,同源性只有79.9%;但是,它与1997年从厦门地区急性戊型肝炎病人血清中检测的X-S1株同源性很高,达99.2%.并对G93-2株病毒的生物学特性进行了研究,结果与87A株一致.表明我国南方散发性HEV毒株的基因组存在差异,可能同时流行着两种不同的HEV基因型,但生物学性状是相同的.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 细胞分离株 基因特征 生物学性状 -
戊型肝炎病毒实验感染恒河猴的研究
报道了用戊型肝炎(Hepatitis E, HE)病人粪便悬液感染恒河猴后的组织病理学、血液生化与免疫学以及病毒学分子生物学检测的结果.三只实验猴在感染后第3～4周均出现ALT异常;粪便以及肝脏与胆囊组织超薄切片中电镜观察到27～34nm大小的病毒样颗粒;病理组织切片观察表明,肝脏组织有典型的急性炎症病灶;粪便与血清经RT-nPCR扩增到戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus, HEV)特异性片段,粪便排毒从感染后第7天持续至第50天左右,病毒血症迟于粪便排毒,出现于感染后两周左右,维持1～2周;ELISA检测发现,实验猴血清中HEV IgG抗体水平在感染后3～4周阳转,4～5个月后转阴.这些实验结果提示,恒河猴作为HEV感染实验动物模型是理想的,建立系统的恒河猴实验模型对探讨HEV感染发病机理、机体免疫应答以及临床诊断与疫苗研制具有重要意义.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 动物模型 恒河猴 -
深圳地区HEV流行基因型及动物宿主带毒状况分析
目的 了解深圳地区戊型肝炎病毒(HEV)流行基因型及动物宿主带毒状况. 方法通过同源比对HEV四种基因型的戊型肝炎病毒序列,选取其保守序列部分设计两对巢式聚合酶链式反应的简并引物,建立一种可同时扩增戊型肝炎四个基因型病毒RNA的PCR快速检测方法.对深圳市采集的80份猪粪便标本和6份戊型肝炎病人血清,提取病毒RNA,然后进行PCR检测,阳性时对扩增片段进行基因序列测定,并进行基因型分析. 结果 80份猪粪便标本5份HEV-RNA阳性,6份病人血清样本中4份阳性.序列分析显示全部为HEV基因Ⅳ型,5份猪标本中的HEV基因序列与GenBank中人HEV的基因序列相似,同源性为88%～94%. 结论深圳地区HEV流行株为基因Ⅳ型,而且猪HEV基因序列与人HEV之间有着高度的相似性,证实猪是HEV的宿主,戊型肝炎是一种人兽共患传染病.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) PCR 基因型分析 -
大理地区猪源甲型、乙型、戊型肝炎病毒血清流行病学调查
目的:调查大理地区猪体内甲、乙、戊型肝炎病毒的感染情况.方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测屠宰生猪血清标本甲肝血清标志物(HAV-lgG和HAV-lgM)、乙肝血清标记物(HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAbHBcAb)、戊肝血清标志物(HEV-lgG和HEV-lgM).结果:HAV、HBV和HEV的感染率分别为:91％(162/178),93.9％(185/197),23.6％(42/178);HAV和HBV二重感染率为67.97％(121/178);HAV、HBV和HEV三重感染率为20.2％(36/178);HAV和HEV二重感染率为1.7％(3/178);HBV和HEV二重感染率为2.2％(4/178).结论:甲、乙、戊型肝炎病毒在猪体内存在感染,同时发现在猪体内甲、乙型肝炎病毒重叠感染常见.
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重庆地区献血人群戊型肝炎病毒的血清学筛查初析
目的 了解大重庆地区(包括重庆主城区及14个主要区县)献血人群戊型肝炎病毒(HEV)的血清学筛查情况.方法 对2017年2-3月大重庆地区的10 008份献血者血液标本完成了常规的血清学HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP和ALT、ABO\\Rh(D)血型初筛后进行ELISA抗-HEV IgM、IgG及抗原检测,并对检测结果进行统计分析.结果 本次筛查显示大重庆地区10 008例标本,HEV IgM反应阳性167例(1.67％);HEV IgG反应阳性4 923例(49.19％);HEV抗原反应阳性2例(0.20％).其中HEV IgG反应性率远高于全国其他地区;献血者在男女比例、职业、婚姻状况和受教育程度上均无统计学差异(P＞0.05),但在年龄和地区上有统计学差异(P＜0.05).结论 大重庆地区献血者中HEV病毒血清学IgM、IgG的反应率较高,有必要进行后续的HEV RNA核酸检测及序列分析,并扩大重庆地区特别是某些HEV反应性率较高区县的筛查数量,为建立适合大重庆地区的区域化血液筛查策略提供数据支撑.
关键词： 献血人群 戊型肝炎病毒(HEV) 血清学 血液筛查
