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人星状病毒Ⅰ型非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表达及鉴定
人星状病毒(Human Astrovirus,HastV)是导致婴幼儿腹泻的重要病原体.HastV非结构蛋白nsP1a及C末端蛋白nsP1a/4含有各种保守的功能结构域,在星状病毒的复制、转录,病毒与宿主的相互作用中起重要作用.为获得nsP1a及其nsP1a/4蛋白,为后续蛋白相关研究提供平台,本研究在E.coli系统中进行人星状病毒非结构蛋白nsP1a及nsP1a/4蛋白的表达并对表达产物进行鉴定.首先将nsP1a及nsP1a/4基因克隆入原核表达载体PGEX-4T-1,构建nsP1a及nsP1a/4蛋白融合表达质粒;在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,摸索两种融合蛋白表达的优条件并对表达蛋白进行免疫印迹鉴定.结果表明nsP1a蛋白在30℃,1mM IPTG诱导12h时,蛋白表达量达到高;nsP1a/4蛋白在20℃,0.5 mM IPTG诱导8h时,蛋白表达量达到高.Western blot结果显示两种融合蛋白既可与nsP1a蛋白免疫血清发生特异性反应,也可被GST标签抗体所识别.本研究成功利用原核系统表达并鉴定了人星状病毒非结构蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4,为进一步研究星状病毒非结构蛋白的功能及病毒的致病机制奠定基础.
关键词： 人星状病毒 非结构蛋白nsP1a nsP1a/4 原核表达 融合蛋白 -
人星状病毒研究进展
人星状病毒是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一,本文回顾了其分子生物学特征、型别、所致疾病特征、致病机制、流行病学特征及检测方法等方面的文献,指出人星状病毒目前存在多种型别,尤其是近年来发现了多种新型的星状病毒,主要的流行型别是血清型1型,不仅引起肠道内感染,还可以引起其他系统疾病,所致疾病特征和其他腹泻相关病毒相似,但是其致病机制的研究尚不清楚,对于几种新发现的星状病毒,其与疾病的相关性研究较少,且未建立完善的实验室检测方法,还需要进一步的研究.
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人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备
目的 原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体.方法 酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件.表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,后1次免疫7d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性.结果 重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22 500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6％,浓度为1.26 mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1:30 000,且特异性较好.结论 成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础.
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人星状病毒临床分离株感染 CaCo-2细胞的转录组分析
人星状病毒（human astrovirus ，HAstV）是引起婴幼儿病毒性腹泻的重要病原之一，但其致病机制及与宿主相互作用的数据非常有限。本研究旨在了解HAstV感染细胞后对宿主基因在转录水平上的影响。首先，利用临床分离 HAstV毒株感染 CaCo‐2细胞，用实时定量反转录‐聚合酶链反应（reverse transcriptase‐polymerase chain reaction ，RT‐PCR）检测细胞培养上清液中的病毒总RNA ，结果显示接种后9～24 h病毒总RNA拷贝数明显增加。然后，利用转录组测序全面比较感染与未感染 HAstV的CaCo‐2细胞转录本，筛选两者间的差异表达基因；并应用KEGG信号通路富集性方法分析差异表达基因相关的信号通路。结果显示，差异基因富集在两条信号通路上（P＜0．05），分别为轴突导向通路和Ras信号通路。本研究首次利用深度测序技术分析了HAstV感染对宿主基因在转录水平上的影响，为进一步研究HAstV致病机制等提供了方向。
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吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒腹泻的分子流行病学研究
目的:研究吉林、兰州地区婴幼儿人星状病毒(HAstV)腹泻流行情况和分子特征.方法:对吉林地区417份和兰州地区290份腹泻标本采用one-step PCR方法检测HAstV,用HAstV基因组ORF1b区部分核苷酸片段初筛,再用ORF2区部分核苷酸序列分型.结果:707份腹泻标本中共检出HAstV阳性17例,总阳性率为2.4%,其中吉林地区和兰州地区分别检出7例和10例.12份HAstV ORF2区阳性的样本均为HAstV 1型,除1株属于Lineage 1a群,其他均属于Lineage 1b群.HAstV主要感染2岁以下婴幼儿,在吉林春季为主要流行季节,而在兰州春季和秋季为主要流行季节.结论:HAstV是引起婴幼儿病毒性腹泻的主要病原之一,HAstV 1型是主要的流行株,2岁以下为感染发病的高危人群,不同地区HAstV流行季节不同.
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辽宁省腹泻患儿中人轮状病毒和人星状病毒的检测
目的:了解辽宁省腹泻患儿中人轮状病毒(Human Rotavirus,HRV)和人星状病毒(Human Astrovirus,HAstV)感染情况.方法:采集5岁以下腹泻患儿粪便标本131份,用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测人轮状病毒,阳性标本用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行血清G分型和基因P分型.用RT-PCR检测人星状病毒,阳性标本进行测序、碱基序列比对,并构建开放读码框ORF2进化树.结果:131份粪便标本中,人轮状病毒PAGE检测阳性29份(22.1%),其中G血清型:G3型13份(44.8%),G1+G3型2份(6.9%),未分型14份(48.3%);P基因型:P[8]型18份(62.1%),P[4]型1份(3.4%),未分型10份(34.5%).人星状病毒RT-PCR检测阳性2份.通过对这2株人星状病毒ORF2基因核苷酸碱基序列进行比对及进化树分析,发现它们与在日本流行的基因1型人星状病毒参考株高度同源.结论:人轮状病毒是引起我省散发婴幼儿腹泻的主要病原;检测到的2株人星状病毒属于1型人星状病毒,这是我省首次检测出人星状病毒.
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人星状病毒非结构蛋白nsP1 a／1相互作用的宿主细胞靶蛋白筛选
目的：利用细菌双杂交技术筛选与人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1相互作用的蛋白。方法培养人肠道细胞HT29，提取基因组，利用细菌双杂交系统载体pUT18 C构建HT29基因组文库，同时构建诱饵载体nsP1a／1?pKT25。将文库和诱饵载体共转化进入细菌BTH101，在M63培养基上进行筛选。结果通过酶切鉴定以及测序分析，诱饵载体构建正确，并且利用细菌双杂交技术成功从HT29细胞基因组文库中筛选出能与人星状病毒非结构蛋白 nsP1a／1相互作用的蛋白。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1的诱饵载体，在HT29细胞基因组文库中筛选得到了3个与nsP1a／1相互作用的蛋白，为进一步研究人星状病毒在细胞内的增殖和防治药物的应用奠定基础。
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人星状病毒非结构蛋白nsP1a／1表达纯化及多克隆抗体的制备
目的：表达纯化人星状体病毒（ human astrovirus， HAstV）非结构蛋白nsP1a／1，免疫动物制备多克隆抗体。方法利用PCR技术扩增nsP1a／1基因序列，构建到大肠埃希菌原核表达系统中表达重组nsP1a／1蛋白，使用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化，十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS?PAGE）和二噻啉甲酸（BCA）实验对重组蛋白的纯度与浓度进行分析，以重组的nsP1a／1蛋白为抗原，免疫雄性SPF级SD 大鼠获得多抗血清，用 ELISA 测定抗体效价、 Western 印迹检测抗体特异性。结果nsP1a／1?pET28a原核表达载体构建成功，将其转化至大肠埃希菌BL21（DE3）细菌中诱导表达了重组蛋白，免疫大鼠获得的多抗血清几何平均效价达到1∶406374。结论本实验成功地运用原核表达系统表达并鉴定了人星状体病毒非结构蛋白nsP1a／1，为进一步研究人星状病毒的复制及病毒感染的临床诊断奠定基础。
关键词： 人星状病毒 非结构蛋白nsP1a/1 原核表达 多克隆抗体 -
人星状病毒非结构蛋白酵母双杂交诱饵表达载体构建及酵母转化子特性鉴定
目的：构建人星状病毒非结构蛋白3（ non-structure protein 1a/3， nsP1a/3）基因酵母双杂交诱饵重组质粒，电转化酵母感受态细胞后鉴定酵母转化子特性。方法聚合酶链反应扩增人星状病毒nsP1a/3编码的基因序列，定向插入到穿梭表达载体pGBKT7改造后的pGBST7中，测序确定无误后将其电转化到Y2HGold酵母感受态细胞中，对细胞特性即nsP1a/3-pGBST7诱饵质粒表达产物的毒性和报告基因自激活作用进行鉴定。结果测序结果表明诱饵重组质粒构建正确，阅读框无误。电转化酵母后，其表达产物对酵母细胞无毒性作用，对报告基因亦无激活作用。结论成功构建了用于酵母双杂交的酵母转化子，为研究nsP1a/3蛋白与宿主细胞具体作用的靶蛋白和HAstV在细胞内的复制机制奠定了基础。
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南宁市腹泻患儿人星状病毒检测及基因特征分析
目的 了解南宁市腹泻患儿人星状病毒的基因特征.方法 收集2013年南宁市某医院儿科门诊腹泻患儿粪便标本201份,采用实时荧光PCR法进行人星状病毒检测,阳性标本再用PCR方法扩增开放读码框2(open reading frame2,ORF2)部分片段并送测序,通过Blast比对和系统进化树分析序列的基因特征.结果 201份粪便标本中检出6份星状病毒阳性,检出率3. 0％(6/201);其中5株测序成功,经Blast比对显示2株为1型,其余3株分别为2、4和5型,系统进化树分析发现1型均为lineage 1a,2型为lineage 2c,4型为lineage 4a,5型毒株与参考株的同源性为94. 0％～99. 0％,不进行lineage划分.结论 南宁市腹泻患儿存在人星状病毒感染,其基因型呈多样性分布.
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人星状病毒1型野毒株的培养及生物学鉴定
目的 研究人星状病毒1(HAstV-1)型野毒株的分离方法、细胞培养适应条件及相应生物学性质.方法 对收集的腹泻粪便样品,采用间接酶联免疫吸附法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)进行HAstV检测.阳性样品按常规方法处理,并进行细胞培养分离及佳培养条件确定,将毒株连续传10代,采用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫荧光法检测病毒的增殖,细胞荧光灶法进行滴度测定,采用RT-PCR进行特异性基因组稳定性检测.结果 通过检测野毒株为HAstV-1d亚型.将其中编号为JZ-10的毒株进行传代培养.该毒株在传代过程中无明显细胞病变,在人结肠癌细胞株(Caco-2)中传代适应培养10代(P10)后,病毒能够稳定增殖并具有良好的识别HAstV抗体的能力.随着传代次数增加,病毒基因拷贝数与病毒滴度增加,P10代病毒基因拷贝数达2.7×107,病毒感染性滴度达6.97 logFFU/ml.在传代过程中,病毒基因组核酸序列稳定,无突变.结论 该实验获得HAstV-1型JZ-10细胞适应毒株,为后续进行该病毒的基础研究奠定基础.
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2013年南宁市某医院2岁以下腹泻患儿诺如病毒和人星状病毒感染分析
目的 了解南宁市2岁以下腹泻患儿诺如病毒(NoV)和人星状病毒(HAstV)的感染情况.方法 收集2013年南宁市某医院儿科门诊2岁以下腹泻患儿粪便标本,采用实时荧光PCR法进行NoV和HAstV检测.结果 201份粪便标本中NoV和HAstV检出率分别为11.4％ (23/201)和3.0％ (6/201),两种病毒混合感染率为1.0％ (2/201),NoV检出率在8～10月出现高峰,50％的HAstV阳性病例分布在1～3月.结论 NoV和HAstV均为南宁市2岁以下腹泻患儿的重要病原,其中NoV检出率与先前研究相比明显下降,HAstV检出率则处于较低水平,推测本地区婴幼儿NoV感染高峰期可能为夏秋季节,HAstV感染则可能多发于冬春季节.
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河南地区5岁以下病毒性腹泻患儿流行特征及病原学监测
目的 分析2011-2014年河南地区5岁以下婴幼儿病毒性腹泻感染状况、季节流行特征及轮状病毒(HRV)血清型基因分型.方法 收集2011年12月-2014年12月单中心郑州市儿童医院住院腹泻患儿粪便共506份.由中国疾病预防控制中心检测轮状病毒(HRV),人星状病毒(HAstV)、人杯状病毒(HuCV)、肠道腺病毒(EAdV)及轮状病毒阳性标本血清型基因分型检测.结果 检测的506份标本中HRV (224) 44.26％、HAstV (83) 16.40％、HuCV(诺如病毒Ⅱ型为主)(58) 11.46％、EAdV (32) 6.32％、未定型(109) 21.54％,HRV是导致河南地区婴幼儿病毒性腹泻的主要病原;每年秋冬季节患儿病毒阳性率检出明显升高;病毒性腹泻各组间所占比例在男女性别上无显著差异;腹泻患儿发病的高峰年龄为6～24月龄,占51.54％ (183/355);224份RV检测阳性标本G血清型和P基因型分布特征,G血清型流行优势毒株为G3型90份(40.17％),未发现G8型.P基因型分型结果显示,常见的毒株是P8型99份(44.19％).基因型组合:以G3P [8]为主;506份检测标本中混合感染共24份(4.74％),以轮状病毒混合其他病毒感染为主,占50％ (12/24),轮状病毒和人星状病毒混合感染多,占29.16％ (7/24);其次,轮状病毒和人杯状病毒混合感染占20.83％ (5/24).混合感染的患儿中＜2岁的占83.33％ (20/24).结论 河南地区5岁以下儿童病毒性腹泻的病原分型复杂,以轮状病毒检出率高,发病高峰在每年秋冬季节,以6～24月龄婴幼儿为主,HRV主要亚型G3 [P8],同时存在不同病原混合感染的现象,具有明显的季节差异和人群分布.
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婴幼儿秋冬季腹泻病毒感染的流行特点分析
目的 研究婴幼儿病毒性腹泻病原的特点,指导临床有效的预防和治疗.方法 取941例腹泻患儿的粪便标本,采用胶体金法检测轮状病毒(Rotavirus,RV)抗原和肠道腺病毒(Adenovirus,AdV)抗原；采用酶联免疫吸附试验(EHSA)法检测杯状病毒(Human Calicivirus,HuCV)抗原和星状病毒(Astrovirus,HAstV)抗原.结果 检出病毒抗原阳性患者651例,总病毒阳性率为69.18％(651/941),RV阳性率为46.97％ (442/941)；AdV阳性率为8.82％(83/941),12例合并RV感染；HuCV阳性率为6.80％(64/941),7例合并RV感染；HAstV阳性率为6.59％(62/941),4例合并RV感染.结论 RV是婴幼儿病毒性腹泻的主要病原,其次是AdV、HuCV和HAstV,且存在混合性病毒感染发生.
