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抗PSMA全人源单链抗体制备、鉴定及初步应用
目的 构建抗PSMA全人源单链抗体库,筛选抗PSMA人源单链抗体(ScFv)并鉴定,应用人源ScFv进行分子显像.方法 从健康人外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人轻链和重链可变区基因,重叠PCR拼接轻重链可变区基因,构建ScFv的表达载体pDF-ScFv,电转染大肠杆菌XL1 Blue,获得噬菌体单链抗体库,酶切鉴定及测序分析,用PSMA抗原进行富集筛选,阳性克隆用Western-Blot 和DNA指纹图谱鉴定.应用直接标记法将125I标记在ScFv上,通过尾静脉注入前列腺癌动物模型体内,2h后进行小动物SPECT/CT显像,观察人源ScFv对前列腺癌的定位性能.结果 成功构建抗PSMA全人源单链抗体库,库容约2.16×108,插入片段经酶切及DNA测序证实为人抗体轻链和重链可变区基因.筛选出6株ScFv阳性克隆,Western-Blot证实6株ScFv均能与PSMA抗原特异性结合,DNA指纹图谱鉴定6株ScFv可变区基因具有多样性.动物模型的分子显像:人源ScFv能与前列腺癌PSMA抗原特异性结合,并使肿瘤显像.结论 成功构建了一个全人源噬菌体单链抗体库,并筛选出了抗PSMA单链抗体,单链抗体在动物模型体内能靶向结合前列腺癌细胞,从而为前列腺癌的靶向诊断和治疗奠定了基础.
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乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究
目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用.方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因,并构建表达HBcAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg,转染PA317细胞,逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBV DNA.结果:成功筛选出HBcAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因,构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体,转染PA317细胞,在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在,上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天,HBsAg、HBeAg逐渐下降,到14d时HBsAg已变为阴性,DNA定量检测无明显变化.结论:HBcAg ScFv能成功地在逆转录病毒载体中表达,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用.
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抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析
目的:实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化,并进行结合活性分析.方法:克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk),利用pET22b表达载体构建重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导,固相亲和层析纯化蛋白,ELISA测定其特异结合活性.结果:pET22b可稳定表达人源单链抗体基因,表达产物占全菌蛋白的25%,表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内.经IMAC纯化,蛋白纯度大于95%.竞争性ELISA测定结果表明,重组抗毒素在体外具有良好的活性,可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合.结论:采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达,重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性.
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抗类风湿人源单链抗体库的制备及筛选
目的 通过噬菌体展示技术构建抗类风湿人源单链抗体库,为其进一步的临床应用研究奠定基础.方法 提取患者外周淋巴细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以人源免疫球蛋白H链和L链可变区的扩增引物,分别扩增出H链和L链可变区基因.采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成sc Fv片段,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中,构建噬菌体单链抗体库.结果 初级库库容量为3×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到1.2×106的次级抗体库.结论 本研究成功构建类风湿人源单链抗体库,拟为类风湿病的预防、诊断、治疗奠定基础.
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人源抗HBsAg scFv与重组复合干扰素融合蛋白的高效表达及活性鉴定
目的:制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)单链抗体(scFv)与重组复合干扰素(consensus interferon,cIFN)的融合蛋白,并鉴定其活性.方法:把人源抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白的表达载体pRA-cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL21之后大量表达抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白.SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白,经纯化并变性复性包涵体蛋白后用ELISA、流式细胞仪、MTS非放射性活细胞比色定量法及HBsAg血凝抑制试验等进行融合蛋白的抗HBsAg抗体活性和干扰素活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blotting结果显示,抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白在BL21大肠杆菌中大量表达,表达量超过10 mg/L培养基;ELISA和流式细胞仪结果显示,所表达的目的蛋白具有抗HBsAg 和IFNα的免疫活性,且特异性良好;MTS和HBsAg血凝抑制试验结果显示,融合蛋白具有明显的PLC/PRF/5细胞增殖抑制活性和HBsAg分泌抑制活性,表明所获得的抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白具有抗HBV病毒活性和HBV感染细胞增殖抑制活性.结论:用基因工程方法成功制备了人源抗HBsAg scFv-cIFN融合蛋白,此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和IFNα活性,有待深入探讨此融合蛋白的应用价值.
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抗T SL P全人源单链抗体筛选与初步鉴定
目的：表达TSLP蛋白，从全人源单链抗体文库中筛选得到抗TSLP单链抗体。方法：扩增TSLP cDNA，将目的基因与表达载体pET101／D-TOPO连接，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定。以生物素化的TSLP蛋白为抗原从前期构建的全人源抗体文库中采用噬菌体展示技术筛选抗TSLP全人源单链抗体（ scFv ）。结果：扩增的TSLP cDNA片段大小为423 bp左右。表达的TSLP蛋白大小为26 kD左右，Dot blot及Western blot鉴定显示表达的蛋白正确，为TSLP目的蛋白。以生物素化的TSLP蛋白为抗原，采用噬菌体展示技术对全人源抗体文库进行3轮富集，通过ELISA检测有35％的scFv与TSLP有结合特性。将筛选的与TSLP结合能力强的单链抗体进行了Western blot鉴定和测序。结论：成功筛选到抗TSLP全人源单链抗体。
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IL-4、IL-13蛋白表达及抗IL-4、IL-13人源单链抗体的筛选
目的:表达IL-4和IL-13蛋白,从人源单链抗体文库中分别筛选抗IL-4和抗IL-13单链抗体.方法:采用RT-PCR从健康志愿者外周血单核细胞(PBMC) mRNA中扩增IL-4和IL-13 cDNA;构建硫氧还蛋白融合表达载体,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化鉴定.以生物素化的IL-4和IL-13为抗原从前期构建的人源抗体文库中采用噬菌体展示技术分别筛选抗IL-4和抗IL-13人源单链抗体(scFv).结果:扩增的IL-4 cDNA大小为280 bp,表达的融合蛋白大小为27 kD左右.扩增的IL-13 cDNA大小为252 bp,表达的融合蛋白大小为25 kD左右.分别以生物素化的IL-4和IL-13蛋白为抗原,采用噬菌体展示技术对人源抗体文库进行3轮富集后,分别有大约37％的scFvs与IL-4有结合特性,有约27％的scFvs与IL-13有结合特性.筛选了4株分别与IL-4和IL-13结合能力强的单链抗体进行了Westem blot鉴定和测序.结论:成功筛选到抗IL-4和抗IL-13人源性单链抗体.
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甲状腺髓样癌人源噬菌体单链抗体的筛选及初步鉴定
目的:从大容量甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)人源噬菌体单链抗体(single chain variable fragments,scFv)库中筛选出特异的抗MTC单链抗体,并对其生物学特性进行鉴定.方法:分别以甲状腺上皮细胞TEC细胞株和MTC细胞TT细胞株为抗原进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集循环,筛选出抗MTC抗体,将筛选出的阳性克隆感染E.coli HB2151;异丙基-β-9-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导抗体可溶性表达,HiTrapTM Anti E-tag柱纯化表达抗体;SDS-PAGE和Western blot检测抗体表达和相对分子质量;ELISA检测可溶性scFv的特异性和免疫活性,分为TT细胞组、SW480细胞组、TEC细胞组和PBS空白对照组,分别检测各组在酶标仪A450nm处的吸光度;四甲基偶氮唑盐比色分析法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)分别检测TT细胞组、SW 480细胞组与不同浓度svFv反应并读取A490nm处的吸光度,设置空白对照PBS组,分别计算细胞抑制率.结果:5轮筛选后,抗体得到了明显富集.随机挑取单个细菌克隆,phage ELISA和scFvELISA阳性率分别为65％和50％.SDS-PAGE、Western blot结果显示MTC特异性抗体分子量为28 kD左右.ELISA结果显示,TT细胞组的吸光度(0.41±0.12)较SW 480细胞组(0.20±0.03)、TEC细胞组(0.13±0.01)、PBS空白对照组(0.07±0.01)明显增加(P=-0.000).MTT法结果显示,TT细胞组和SW 480细胞组在scFv浓度为0.1、1、10 mol/L时,2细胞株间抑制率有统计学意义,统计量分别是t=2.881,P=0.02;t=5.073,P=-0.006;t=7.324,P=0.000,且在scFv浓度为10 μmol/L时,对TT细胞的抑制率高(0.59±0.15)％.结论:利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性的抗MTC人源单链抗体.
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甲状腺未分化癌人源单链抗体制备及初步鉴定
目的 从大容量甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)人源单链抗体(single chain variable fragments,scFv)库中筛选特异性抗ATC单链抗体并进行生物特性鉴定.方法 对该抗体库进行4轮筛选后,挑取抗ATC阳性克隆感染E.coliHB2151;并用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导该scFv抗体可溶性表达,ELISA法检测其可溶性表达;经HiTrapTM Anti E-tag亲和柱层析纯化抗体;细胞ELISA鉴定可溶性抗体与细胞结合的特异性,分别设置TT细胞、ARO细胞、人肝癌Hep G2细胞及PBS空白对照组,用酶标仪检测各组在450 nm处的吸光度.SDS-PAGE法及Western blot检测抗体的表达和相对分子质量;流式细胞术观察细胞凋亡情况.结果 经4轮筛选后抗体实现了显著富集,并得到了纯化抗体.ELISA结果表明筛选出的抗体与甲状腺未分化癌细胞能够特异性结合.SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ATC抗体的相对分子质量约为2.9×104.流式细胞术结果显示ARO细胞经scFv特异性作用后细胞明显凋亡.结论 成功获得抗ATC特异性人源单链抗体,鉴定结果显示抗体活性较好.
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利用大型天然噬菌体抗体库筛选抗死亡受体5人源抗体
目的 从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗人死亡受体5(DR5)单链抗体(scFv)并对其抗原结合活性进行鉴定.方法 以前期真核表达纯化的DR5-Fc蛋白包被筛选管,从自主构建的大容量天然噬菌体抗体库中,通过4轮筛选过程获得噬菌体抗体,采用免疫细胞化学染色、ELISA鉴定其抗原结合活性;DNA指纹图谱分析和序列测定确定其抗体类型.结果 经过4轮筛选,获得26株与DR5特异性结合的阳性克隆,DNA指纹分析有4种不同的可变区片段;经过基因测序,分析可变区基因的亚群,并将其制备成可溶性的抗体,进一步用免疫细胞化学技术证实所获得的抗体可特异性结合SW480细胞的DR5蛋白.结论 利用噬菌体抗体库技术成功获得了特异性抗DR5的人源性scFv.
