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DiI在人体神经解剖学中的应用
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物,再用这种荧光标记抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体).在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光,可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术测定含量.
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神经再生素促大鼠背根神经节生长作用的研究
目的研究神经再生素(NRF)对体外培养新生大鼠背根神经节生长及NF-H表达的影响.方法体外大鼠背根神经节(DRG)培养;免疫荧光细胞化学、实时荧光定量PCR和Western blot等方法.结果免疫荧光细胞化学结果提示,NRF能促进背根神经节神经突起的生长,浓度为2.0 mg/L时生长状况佳;实时荧光定量PCR和Western blot结果提示,NRF能增加体外培养的背根神经节NF-H mRNA和蛋白的表达,在浓度为2.0mg/L时表达高.结论NRF能促进体外培养背根神经节神经突起的生长和NF-H的表达,表明NRF对发育期感觉神经元具有神经营养作用.
关键词： 神经再生素:背根神经节 神经丝蛋白 实时荧光定量PCR 免疫荧光细胞化学 大鼠 -
抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测条件探讨
目的：建立一种简单、实用、准确的抗黑素细胞抗体免疫荧光细胞化学检测方法，用于白癜风患者血清抗黑素细胞抗体的检测及其相关抗原分析研究。方法青少年包皮组织经分离酶（Dispase）Ⅱ及胰酶消化后，获取细胞悬液，用M2黑素细胞培养基及Accutase细胞消化液选择及扩大培养，取第3代黑素细胞在培养皿中直接用冷甲醇固定（－20℃），白癜风患者及健康人血清用抗体稀释液按1：10比例稀释进行反应，洗涤后加入FITC标记的羊抗人抗体，封片后荧光显微镜下观察；取不同荧光强度的标本血清用Western-Blot法进一步验证检测。结果获得高纯度、高活性的黑素细胞，黑素细胞在培养皿中经冷甲醇直接固定后细胞形态保持完整，实验过程无脱落，与白癜风患者及健康人对照血清反应后在荧光显微镜下发出不同亮度荧光，强阳性血清荧光强度+++～++++，发光部位为黑素细胞胞质和胞膜；弱阳性血清发光较明亮，亮度+～++，发光部位主要集中在胞膜；阴性血清不发光，只见隐约细胞轮廓，相同血清经重复检测2次后结果相同；经Western-Blot检测后证实黑素细胞胞质和胞膜有多种蛋白与抗黑素细胞抗体阳性血清结合，蛋白染色带的部位及颜色深浅与免疫荧光法检测结果相一致。结论本文建立的抗黑素细胞抗体的免疫荧光细胞化学检测方法简单、准确、重复性好，可全面地反映体内抗黑素细胞抗体表达水平，适用于临床检测及相关抗原的基础研究。
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滋补脾阴方药对大鼠树突棘保护作用的机制
目的 探讨滋补脾阴方药的神经保护作用与树突棘形态调节之间的相关分子机制.方法 荧光显微镜和免疫荧光细胞化学方法观察滋补脾阴方药含药血清预处理与谷氨酸处理前后大鼠树突棘的形态结构变化及树突棘内树突棘相关的Rap特异性GTPase活化蛋白(SPAR)、血清诱导激酶(SNK)的表达变化情况.结果 2%浓度的滋补脾阴方药含药血清预处理对于谷氨酸引起的原代海马神经元树突棘的损伤有明显的保护作用.结论 滋补脾阴方药的神经保护作用与维持树突棘正常的形态和结构有关.
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免疫细胞化学法检测尿足细胞的临床应用
目的:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞的比较,以促其临床推广应用.方法:尿标本均为我科住院患者的肾活检日新鲜晨尿,采用抗人足细胞标记蛋白Podocalxin(PCX)单克隆抗体进行尿沉渣免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色.14例患者均经肾活检,肾组织由光镜、免疫荧光和电镜检查做出病理诊断.结果:(1)14份尿标本应用免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学方法均可检测到足细胞.(2)同一份尿沉渣采用免疫荧光细胞化学法检测足细胞均数为(16.7±15.1)/HP,而免疫酶细胞化学法检测足细胞均数为(26.1±24.3)/20 HP,两组比较有统计学意义(P＜0.05);但两种方法所测足细胞数之间有很好的相关性(r＝0.969).结论:免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学两种方法检测尿足细胞,前者较简便、镜下易辨认,后者设备简单、标本可保存.
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免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色方法检测IgA肾病患者尿足细胞的效果比较
目的:比较免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色2种方法检测IgA肾病(IgAN)患者尿足细胞的效果,为尿足细胞检测方法的选择提供依据.方法:收集43例确诊为IgAN患者(实验组)和10例正常对照研究对象(对照组)活检前连续3d的晨尿各200 mL,离心上清制成涂片.IgAN患者按Lee分级分成Lee Ⅰ～LeeⅤ组.采用抗人足细胞表面标记蛋白Podocalyxin (PCX)单克隆抗体对尿沉渣涂片分别行免疫荧光细胞化学和免疫酶细胞化学染色,荧光显微镜和普通光学显微镜下计数2组研究对象尿足细胞数;采用Spearman相关分析法分析2种方法检测IgAN患者尿足细胞数的相关性.结果:2种方法检测的对照组研究对象尿中未见足细胞,2种方法检测实验组研究对象尿中均可见足细胞;免疫荧光细胞化学法检测足细胞阳性率和检出中位数低于免疫酶细胞化学法,2种方法检测尿足细胞阳性率和中位数比较差异均有统计学意义(P＜0.05);2种方法检查患者尿足细胞数呈明显的正相关关系(r=0.842,P＜0.01).结论:采用免疫酶细胞化学法检测同一份尿标本的效果优于免疫荧光细胞化学法.
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骨髓间充质干细胞的体外培养及定向诱导分化
目的:探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养生长特性及其在体外定向分化为神经样细胞的条件.方法:采用Ficoll-paque(1.077g/ml)分离液密度梯度分离hMSCs,显微镜下观察其生长特性,测定生长曲线;取传至3～6代的hMSCs,用阿魏酸钠对其进行诱导培养,并以β-巯基乙醇作对照观察诱导培养后细胞的形态变化,分别在6h、1d、3d和7d通过免疫荧光细胞化学染色方法测定诱导后细胞的神经元烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glia fiber acid protein,GFAP),进行定量分析.结果:体外培养条件下hMSCs呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,细胞倍增时间约为72h.阿魏酸钠诱导培养后6h可见细胞形态明显变化,NSE和GFAP表达阳性.24h后诱导细胞表现为典型的神经细胞样形态.第3天,NSE和GFAP表达高,分别为67±3.5%和39±1.8%.结论:人骨髓间充质干细胞在体外具有自我更新能力及多分化潜能;阿魏酸钠具有诱导体外培养的人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.
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FHL2蛋白与心脏Kv1.5钾通道相互作用的研究
目的 目前认为KCNA5通道蛋白是治疗房颤的一个理想靶点,文中旨在验证FHL2蛋白与KCNA5基因编码的心脏Kv1.5钾通道是否存在相互作用.方法 ①质粒构建:应用PCR法构建质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2;②基因转染:应用Lipofectamine 2000将pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5质粒和pcDNA3.0-FHL2质粒共转染HEK293细胞;③免疫共沉淀:应用抗FHL2抗体和Protein A/G Plus-Agarose沉淀目的 蛋白,应用抗Myc抗体进行Western blot分析;④免疫荧光细胞化学分析:应用抗FHL2一抗和标记有FITC的二抗检测FHL2蛋白,应用抗Myc一抗和标记有Cy3的二抗检测KCNA5-Myc融合蛋白.结果 ①酶切和测序结果表明质粒pcDNA3.1/myc-His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2构建正确;②抗FHL2抗体能够将KCNA5从总蛋白中沉淀下来;③KCNA5蛋白和FHL2蛋白共定位于细胞膜上.结论 初步证实FHL2蛋白与KCNA5蛋白存在相互作用.
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免疫细胞化学双染技术探讨
在临床与实验病理研究中,常用到免疫细胞化学双染技术.它可在同一细胞内定性、定位、定量的显示出两种抗原成分,利于研究人员了解细胞间的形态和机能的关系,以及抗原成分间的相互关系.
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成年 SD 大鼠海马齿状回神经干细胞分离培养和鉴定的改良
目的：改良成年SD大鼠神经干细胞分离、培养及鉴定方法，观察神经干细胞的生长、增殖及分化特点，为后续实验提供细胞。方法从成年SD大鼠分离出完整海马齿状回，采用机械吹打法获得原代细胞，用accutase消化传代，利用cck-8法检测神经干细胞的增殖情况，利用多重免疫荧光细胞化学方法鉴定神经干细胞及其分化细胞。结果机械吹打法可高效获得原代神经干细胞，accutase消化传代更有利于神经干细胞的传代培养，cck-8法简单高效的测定了神经干细胞的增殖，多重免疫荧光创新性的动态展示了神经干细胞经诱导分化后的分化过程。结论改良后的方法可更简单高效的获得和培养出大量细胞，经多重免疫荧光鉴定所分离和培养的细胞是神经干细胞。
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切应力诱导内皮细胞表达IL-8基因的信号转导
目的:现已确定动脉粥样硬化是一种炎症疾病,单核/巨噬细胞在动脉内膜下集聚是导致动脉粥样硬化损伤发展的基础;血流低切应力促进其损伤的发展.趋化细胞因子MCP-1对单核/巨噬细胞起强力趋化和激活作用,并有报告切应力可诱导其基因的表达.新近报道在层流作用下IL-8亦是单核/巨噬细胞与内皮细胞相互作用的重要调节因子.本研究旨在观察切应力诱导人脐静脉血管内皮细胞IL-8 mRNA的表达,探讨Toll/NF-κB信号转导通路对其基因激活的介导作用.方法:4.2 dyn/cm2层流切应力处理人脐静脉血管内皮细胞,提取总RNA,应用RT-PCR和Northern杂交技术检测切应力作用不同时间后IL-8、TLR-2和TLR-4 mRNA的表达.免疫印迹技术检测IκB磷酸化和降解.免疫荧光细胞化学染色检测NF-κB胞核易位.结果:切应力作用0.5 h后IL-8 mRNA表达逐渐增高,2 h时达到很高水平.胞浆蛋白IκB和磷酸化IκB的免疫印迹显示4.2 dyn/cm2层流切应力作用10 min后磷酸化IκB水平即显著增加,30 min后又逐渐下降,与之相应IκB含量随切应力作用时间而逐渐下降,到1 h时几乎测不出,表明在切应力作用下内皮细胞胞浆NF-κB抑制因子IκB发生了磷酸化和降解.NF-κBp65亚基免疫细胞化学染色显示在4.2 dyn/cm2切应力作用0.5 h后内皮细胞核逐渐着色,1.5 h时细胞核几乎全着色,表明胞浆NF-κB在切应力作用下发生了易位,从胞浆进入胞核.RT-PCR检测和Northern杂交分析显示内皮细胞固有表达TLR-2和TLR-4 mRNA,在4.2 dyn/cm2切应力作用1 h后TLR-4 mRNA的表达显著增强,而TLR-2 mRNA的表达变化不明显.结论:流体切应力可诱导血管内皮细胞表达IL-8,活化转录因子NF-κB.在切应力作用下内皮细胞TLR-4 mRNA表达增强,提示Toll/NF-κB信号转导通路可能参与动脉粥样硬化性炎症反应.
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Caveolin-1蛋白与心脏HERG钾通道相互作用的研究
目的 验证Caveolin-1蛋白与HERG钾通道是否存在相互作用,并进一步明确发生相互作用的区域.方法 (1)将携带不同Caveolin-l片段的pGADT7载体转染Y187,随后分别与转化有pGBKT7-herg-NT或pGBKT7-hergCT的AH109进行酵母双杂交;(2)应用免疫共沉淀技术验证Caveolin-1与HERG之间的相互作用;(3)免疫荧光细胞化学分析:pcDNA3.1-HERG和pcDNA3.0-Caveolin-1质粒共转染HEK293细胞,应用特异性抗体和荧光标记二抗显示Caveolin-1及HERG的亚细胞定位,应用激光共聚焦显微镜观察.结果 (1)酵母双杂交发现,Caveolin-1与HERG氨基端相互作用,且其寡聚化结构域是必需片段,而Caveolin-1羧基端则与HERG羧基端相互作用;(2)抗Caveolin-1的抗体能够从心肌裂解物中沉淀HERG通道蛋白;(3)Caveolin-1蛋白和HERG通道共定位于细胞膜上.结论 Caveolin-1与心脏HERG钾通道存在相互作用,Caveolin-1的寡聚化结构域是HERG氨基片段的相互作用区域,而HERG羧基片段则与Caveolin-1的羧基端相互作用.
关键词： Caveolin-1 HERG钾通道 免疫共沉淀 免疫荧光细胞化学 -
TRAIL抑制原代卵巢癌细胞增殖及诱导凋亡的实验研究
目的 观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对原代卵巢癌细胞的生长抑制和诱导凋亡情况.方法 选择12例患者的原代卵巢癌细胞.每例癌细胞分为6组.分别给予TRAIL 0、5、10、20、50、100 μg/L,分别作用24、48、72、96 h.(1)噻唑蓝(MTT)比色法检测TRAIL对原代卵巢癌细胞生长抑制情况.(2)免疫荧光细胞化学法检测原代卵巢癌细胞的凋亡.结果 TRAIL对原代卵巢癌细胞的抑制呈剂量依赖性,浓度大于20 μg/L,后抑制下降;相同浓度TRAIL对原代卵巢癌细胞的抑制呈时间依赖性.72 h后抑制下降;TRAIL浓度相同时随作用时间延长凋亡细胞数增多,5μg/L 24、96 h凋亡细胞数分别为(28±1.18)和(55±4.12),凋亡也呈剂量、时间依赖性.结论 TRAIL抑制了原代卵巢癌细胞的增殖、生长并诱导了癌细胞的凋亡.
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流体切应力对内皮细胞IL-8基因表达的影响及信号转导
目的流体切应力对于维持血管的稳定有着重要的作用.另外在一些病理情况下,例如动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病的发病过程中,流体切应力也扮演着关键角色.我们以往的实验结果证实:以低流体切应力(4.2dyne/cm2)处理培养的人脐静脉内皮细胞1 h,其IL-8mRNA的表达上调;处理2 h其表达量上调更为明显.在本实验中我们将进一步阐明流体切应力对培养的人脐静脉内皮细胞IL-8基因表达、蛋白生成的影响及其信号转导途径.方法分别用实时定量RT-PCR及定量三明治ELISA检测IL-8基因表达及蛋白生成;通过基因转染及流式细胞数检测IL-8报告基因pEGFP1-IL8USCS经流体切应力作用后的激活情况;用免疫荧光化学染色观测对照和层流切应力处理以后NF-κB核转移情况;将对照和层流切应力处理后的内皮细胞裂解物进行I-κB和磷酸化的I-κB的免疫印迹实验,以检测切应力诱导的I-κB磷酸化和降解的情况;RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光细胞化学染色观察TLR-4和TLR-2在人脐静脉内皮细胞上的表达;用RT-PCR技术从血管内皮细胞扩增胞内区段缺失突变TLR-4 cDNA克隆于真核表达质粒pcDNA3,构建重组TLR-4胞内缺失突变基因真核表达质粒pcDNA3-mTLR4,与pEGFP1-IL8USCS共转染内皮细胞,流式细胞术观察mTLR4对切应力诱导IL-8报告基因表达的影响.结果和讨论(1)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,1 h IL-8 mRNA表达增加,2 h IL-8 mRNA表达量至高值,3 h IL-8 mRNA表达量开始下降,4 h后IL-8 mRNA持续相对高表达;各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8 mRNA随时间的变化规律,即IL-8的表达对切应力有时间依赖性.(2)未用切应力处理的内皮细胞没有IL-8基因的表达;切应力处理内皮细胞后,低切应力时IL-8 mRNA表达量明显增加,高切应力时IL-8 mRNA表达量较低.IL-8 mRNA的表达量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;不同的切应力作用时间(1、2 h)均表现出相同的IL-8 mRNA随切应力强度的变化规律.提示流体切应力诱导内皮细胞表达IL-8,不仅与切应力的作用时间有关,而且IL-8的表达量与切应力作用强度有关,两者之间具有明显的直线负相关.直线回归方程:1 h时为y=7.57-0.11x,相关系数r=-0.97;2 h时为y=7.92-0.10 x,相关系数r=-0.96.(3)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞1 h后,IL-8蛋白质生成量增加,处理5 h后IL-8蛋白质生成量增加至高值,处理8 h后IL-8蛋白质生成量下降,10 h后IL-8蛋白质生成量维持在一个较高的水平.各实验组(2.23、4.20、6.08 dyne/cm2)均表现出相同的IL-8蛋白质生成量随切应力作用时间的变化规律.提示流体切应力确实可以诱导内皮细胞生成IL-8,并且IL-8的生成量与切应力的作用时间有关,呈双相性变化.(4)未用切应力处理的内皮细胞只有极少量的IL-8蛋白质生成;切应力处理内皮细胞后,低切应力(2.23 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量明显增加,为高切应力(19.29 dyne/cm2)时IL-8蛋白质生成量的约6(作用5h)或7倍(作用6h).IL-8蛋白质生成量与内皮细胞所施加的切应力强度呈反变关系;直线回归方程:5 h时为y=760.12-36.06x,相关系数r=-0.978;6 h时为y=781.87-36.66x,相关系数r=-0.980.(5)pEGFP1-IL8USCS转染细胞,层流切应力刺激3 h后IL-8报告基因绿色荧光蛋白表达增强.(6)NF-κB p65免疫荧光细胞化学染色显示,切应力刺激0.5 h,胞核即出现阳性反应,刺激1.5 h后,胞核呈强阳性染色.(7)细胞裂解物免疫印迹显示,刺激10 min时磷酸化IκB即显著增强,1 h后磷酸化IκB印迹强度降到无,而IκB随刺激时间延长而逐渐降低,0.5和1 h后降至测不到IκB.(8)免疫荧光细胞化学染色显示脐静脉血管内皮细胞膜表达TLR-4.RT-PCR和Northern杂交显示,人脐静脉血管内皮细胞表达TLR-2和TLR-4 mRNAs;当切应力刺激1 h后,TLR-4 mRNA表达明显增强.pcDNA3-mTLR4和pEGFP 1-IL8USCS共转染细胞,层流切应力刺激3 h后荧光蛋白表达未明显增强.本实验中我们采用的切应力为2.23、4.20、6.08 dyne/cm2,这些切应力与动脉血管分叉处等低切应力区生理切应力大小相似,在这些低切应力区,血管内皮细胞可分泌IL-8,IL-8转而激活中性粒细胞和单核细胞,调控它们和内皮细胞的黏附,这将触发一系列的病理变化,例如:动脉粥样硬化等.结论流体切应力诱导内皮细胞IL-8 mRNA的表达及IL-8蛋白的生成,在感染及动脉粥样硬化等病理过程中扮演着重要角色.
