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蝰蛇毒压电免疫传感器的研制
采用聚乙烯亚胺(PEI)科学仪黏附、戊二醛(Glu)交联的方法,将抗蝰蛇毒IgY固定于石英品体表面,制成蝰蛇毒压电免疫传感器.该传感器用于检测浓度范围为0.5～100μg/mL的蝰蛇毒时,呈线性相关,相关系数为0.962,具有良好的选择性.
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副溶血性弧菌高免卵黄抗体的制备和不同提纯方法效果的比较
目的:通过比较聚乙二醇(PEG)沉淀法、氯仿抽提法和氯仿/PEG法3种卵黄抗体(IgY)提纯方法的提纯效果,为批量提纯高质量IgY提供依据.方法:制备副溶血性弧菌灭活疫苗,采用肌肉多点注射法免疫高产蛋鸡,收集鸡蛋,分别采用PEG沉淀法、氯仿抽提法和氯仿/PEG法对鸡蛋中的IgY进行提纯,比较3种提纯方法获得的IgY的蛋白质量浓度、抗体效价和纯度,结合操作过程、成本效益及安全性对3种提纯方法进行综合分析比较.结果:3种方法所提纯的IgY中,蛋白质量浓度从高到低依次为氯仿抽提法、氯仿/PEG法、PEG法;抗体效价相差不大,氯仿抽提法稍高;抗体纯度由高到低依次为PEG法、氯仿/PEG法、氯仿抽提法.PEG法安全性较好,但提取效率相对较低,成本投入较高;氯仿抽提法能够高效地从卵黄中获得IgY,但提取物中掺杂了大量的杂质蛋白;氯仿/PEG法提纯效率高,抗体纯度好,成本效益相对较高.结论:PEG法适用于实验室中少量IgY的提取;氯仿/PEG法的提取效率高,抗体纯度好,可用于批量提取高质量的IgY.
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鸡卵黄抗幽门螺杆菌-IgY的特性研究
人群中幽门螺杆菌(Hp)感染率高,其与慢性胃炎、消化性溃疡和胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤有密切关系,是胃癌的Ⅰ类致癌原.目前常规治疗多采用抗生素三联疗法,但因Hp易耐药而导致治疗失败.鸡卵黄免疫球蛋白G抗体,又称IgY,是卵黄中惟一的免疫球蛋白,具有与血清IgG一样的抗体活性[1].特异性鸡卵黄抗体IgY对病原体感染的防御无动物种属的差异,这为IgY防治人类疾病的应用奠定了基础.抗Hp-IgY是治疗Hp的一个新研究方向,近年日益受到关注.因此,我们检测抗Hp-IgY的理化特性和生物学特性,为抗Hp-IgY的开发和应用奠定基础.
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奥丽汀健齿露对龋病活跃性的影响
目的通过检测龋病活跃性的变化,了解奥丽汀健齿露(主要成分为鸡卵黄抗体-IgY)的被动免疫防龋效果.方法将72名3～4岁健康幼儿随机分为2组:使用奥丽汀健齿露组和使用安慰剂组.健齿露组每日晚上睡前喷服,连服2个月为1疗程.安慰剂组同法进行.实验前、后各进行1次变形链球菌菌落的测定(Dentocult SM)、乳酸杆菌计数(Dentocult LB)和变形链球菌产酸能力的测定(Cariostat,CAT)3种龋病活跃性的检测,观察龋病活跃性的变化情况.结果健齿露组自身实验前、后龋病活跃性的减弱差异有显著性(P＜0.01);与安慰剂组比较,实验后龋病活跃性的差异有显著性(P＜0.01).结论奥丽汀健齿露能有效降低机体的龋病活跃性,在预防龋病的发生、发展中能起到一定的作用;对幼儿为一种操作简便、见效快捷的防龋新方法.
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鸡卵黄抗体Fab'的制备及鉴定
目的 鸡卵黄抗体(immunoglobulin Y,IgY)的活性片段Fab' 免疫原性低,可口服用于预防胃肠道感染.文中制备并鉴定IgY Fab'片段. 方法 采用胃蛋白酶水解法制备Fab',对酶与IgY混和质量比、pH值、酶解时间进行优化;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及Western blot对酶解产物进行鉴定. 结果 胃蛋白酶∶ IgY的质量比为1∶ 40,缓冲液pH 4.2,酶解时间9h的条件下,可得到无pFc片段的特异性抗体Fab'片段. 结论 获得制备IgY Fab'的佳条件,得到的Fab'产量高、纯度高,特异性强,是规模化制备特异性Fab'片段的良好的实验方法.
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鸡卵黄抗体(IgY)的性质、提纯及应用于寄生虫学的研究
免疫学IgY技术是近几年发展起来的一种新的生物技术领域及医药研究中的热点技术.本文简要综述鸡卵黄抗体(IgY)的特性、提纯及应用于寄生虫病免疫诊断及免疫治疗等方面,以开拓寄生虫病防治.
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鸡卵黄抗体(IgY)的提纯及其在医学上的应用
鸡卵黄免疫球蛋白G抗体是一种7S免疫球蛋白,与哺乳动物IgG略有不同.该蛋白质分子量约为180kDa,含两个亚单位,即67～70kDa的重链和22～30kDa的轻链[1],又称IgY(Yolk Immunoglobulin),存在于免疫后母鸡的卵黄中.实验证明,受免疫刺激后,母鸡产生免疫反应,在输卵管内卵黄成熟期,血液中IgG可被选择性地转移到卵黄中,而且是卵黄中唯一的免疫球蛋白类[2].早在60年代,科学家们就发现鸡卵黄中存在IgG抗体[3,4],其含量与鸡血清相似甚至更高,但一直未引起足够的重视.显然是由于很难将IgG抗体从丰富的卵黄脂质中分离出来,使得鸡蛋作为抗体来源的研究受到限制.直到80年代初,Polson和Jensenius相继建立了有效且相对简便的聚乙二醇(PEG)提取法[5]和硫酸葡聚糖提取法[6],有关这方面的研究便如雨后春笋般大量涌现,并且被广泛应用在生物学的许多领域.
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鸡卵黄抗体制备的C-反应蛋白试剂测定人血清CRP的研究
有良好的相关性(y=0.988),y=0.985×+0.01mg/L.结论 采用鸩卵黄抗体制备的CRP试剂测定人血清C-反应蛋白特异性好、准确度高、精密度好,能够满足临床检测的需要,可广泛应用于各级医疗机构.
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蝰蛇毒压电免疫传感器固定方法的研究
目的:为研制蝰蛇毒压电免疫传感器,研究抗蛇毒抗体固定于石英晶体银电极表面的固定技术.方法:采用马抗蝰蛇毒血清抗体和抗蝰蛇毒鸡卵黄抗体作为生物敏感材料,对比研究了胱胺自组装-PSS反相吸附法和PEI粘附-戊二醛交联法;比较了采用两种固定方法所制的压电免疫传感器的性能.结果:鸡卵黄抗体采用PEI粘附-戊二醛交联法效果较好,其制备的IgY压电免疫传感器检测蝰蛇毒灵敏度为0.5μg/mL;而马血清抗体用胱胺自组装-PSS反相吸附法较好,其制备的IgG'免疫传感器检测蝰蛇毒灵敏度为10μg/mL.结论:以PEI粘附一戊二醛交联法固定抗蝰蛇毒鸡卵黄抗体所制备的蝰蛇毒压电免疫传感器的性能稳定,特异性好,可实现蛇毒的快速检测.
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鸡卵黄抗体及其在免疫防龋中的应用研究
用某种抗原免疫产蛋的母鸡时,鸡可产生相应的多克隆抗体--免疫球蛋白,并被运送和储存到鸡卵的卵黄中,这种免疫球蛋白称为鸡卵黄抗体(IgY).免疫母鸡提取IgY可以代替免疫小鼠、豚鼠、兔等制备抗体的常规方法[1].齿是人群中广为流行的疾病之一,变形链球菌(S.mutans简称变链)是其主要致病菌[2].用变链或其亚单位免疫母鸡,提取IgY用于预防龋齿有良好的应用前景.
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鸡血清与卵黄中抗中华眼镜蛇毒IgY动态变化研究
目的 探索特异性IgY的产生和变化规律.方法 用眼镜蛇毒原毒免疫产蛋母鸡,ELISA定期检测卵黄中的抗体效价变化,小鼠体外中和实验检测其生物活性.第1次免疫40周后,眼镜蛇毒攻击已免疫母鸡,检测攻击前后鸡血清中抗体效价变化情况,未经眼镜蛇毒免疫的母鸡作阴性对照.结果 经免疫后第7天蛋黄中即可检测到抗体,经多次加强免疫,40周时蛋黄中还能保持高效价的抗体,通过分离纯化,此抗体可保护实验小鼠免受4 LD50眼镜蛇毒的攻击;同时,鸡血清中也保留着较高效价的抗体,可中和4 LD50以上的眼镜蛇毒.结论 用眼镜蛇毒免疫鸡,经多次加强免疫,卵黄和鸡血清中可持久保持高效价的特异性抗体,初步检测此抗体可中和4 LD50的蛇毒.
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抗蝰蛇毒IgY灌胃对蝰蛇伤小鼠保护作用的研究
目的 探讨抗蝰蛇蛇毒鸡卵黄抗体(immunoglobulin yolk,IgY)经腹腔注射或灌胃对蝰蛇伤小鼠保护作用,为其口服制剂的应用奠定理论基础.方法 用蝰蛇原毒单一抗原免疫母鸡,收集第12天以后的鸡蛋,用水稀释法提取抗蝰蛇毒IgY;间接法ELISA检测IgY的效价和灌胃小鼠体内IgY的吸收时间;以胃排空率实验确定蛇伤前灌胃IgY的佳时间,以腹腔注射和不同浓度IgY灌胃实验分别检验IgY对蝰蛇伤小鼠的保护作用.结果 初次免疫后第12天开始收集抗体,水稀释法提取的IgY效价为1∶6400;不同浓度IgY灌胃后,2.5～3.5 h胃排空率均达61.8%以上,血浆中抗体效价亦相应达高峰;腹腔注射和IgY灌胃实验对蛇伤小鼠的保护作用明显,小鼠的存活时间与阴性IgY组小鼠相比差异显著(P＜0.05);同等效应下,灌胃IgY的有效剂量大约为腹腔注射的10～15倍.结论 抗蝰蛇蛇毒IgY经腹腔注射和灌胃实验均能有效保护蝰蛇伤小鼠.
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抗铜绿假单胞菌IgY的制备优化及抑菌效果
目的 探讨高效价、高纯度且生物活性好的抗铜绿假单胞菌(PA)的特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)的制备工艺.方法 采用超声破碎、共振裂解、研磨破碎等方法裂解PA,筛选出佳裂解抗原,然后将裂解抗原或经甲醛灭活的全菌抗原与佐剂充分乳化免疫产蛋母鸡;采用酶联免疫吸附试验检测水稀释后的Ig Y抗体效价变化;通过硫酸铵盐析,超滤法纯化抗体,并用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝电泳法(SDS-PAGE)和二喹啉甲酸(BCA)法测定抗体纯度和浓度,平板法评价IgY对PA的抑菌效果,并以蒸馏水作为对照;扫描电镜法检测细菌形态变化.结果 超声破碎法裂解的PA抗原浓度高且蛋白条带为完整;0.5 mL的1×109 CFU/m L灭活菌初次免疫4周后再次免疫的方案产生的抗体效价高,可高达1:25600;硫酸铵沉淀,超滤纯化后的抗体纯度可达94％,浓度为27.02 mg/mL;IgY体外抑菌试验表明,2.7 mg的抗体能明显抑制PA生长,与蒸馏水对照组相比,IgY试验组菌落数减少了9/10,并且明显抑制了细菌绿色色素的产生;扫描电镜观察Ig Y试验组菌体较长、较大且皱缩.结论 采用灭活全菌免疫母鸡,经水稀释、硫酸铵沉淀、超滤纯化的制备方法可得到高纯度和高效价的抗PA IgY,所制抗体具有特异性和显著抑菌活性.
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抗白色念珠菌IgY的稳定性与应用研究
目的观察抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体IgY的稳定性与体外生物学效应.方法用水溶法从免疫鸡蛋黄中提取抗白色念珠菌抗体IgY,ELISA法检测抗体耐热、耐酸、耐碱的稳定性,观察IgY抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞(IEC-6).结果 IgY在巴氏消毒后活性为对照的61%,在pH 7.0至3.0酸性环境中活性改变不显著,在pH 7.9,37 ℃作用150 min活性仍为对照的60%.IgY在10 mg/ml时能明显抑制白色念珠菌生长和对肠上皮细胞的粘附,明显降低细胞上清二胺氧化酶(DAO)释放.结论鸡蛋黄抗体IgY具有高度稳定性和良好的体外生物学效应.
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抗内毒素IgY体外拮抗内毒素效应的实验研究
目的观察抗内毒素鸡卵黄抗体(IgY)在体外拮抗内毒素(LPS)的作用.方法①用不同浓度IgY与LPS直接体外中和作用,检测剩余LPS的量,观察二者的量效关系;②以培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型,加入一定浓度的FITC-LPS及IgY,观察各时相点细胞的荧光强弱变化;③加入一定浓度的LPS及IgY,观察各时相点培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性变化.结果①当二者浓度比为16:1时,有较好的量效关系;②在4、8、12 h 3个时相点,单纯FITC-LPS结合组细胞均显示较亮的荧光,且强弱没有明显的区别,在IgY拮抗组的3个时相点,荧光均有减弱,以8、12 h较明显;③LDH的活性在LPS攻击8 h后明显升高(P＜0.01),IgY拮抗组LDH的活性在8h后明显降低(P＜0.01).结论在体外,特异性IgY有较强的拮抗LPS的作用.
关键词： 鸡卵黄抗体 内毒素 人脐静脉内皮细胞 乳酸脱氢酶 异硫氰荧光素-内毒素 -
抗白色念珠菌鸡卵黄抗体(IgY)的研制
目的观察鸡蛋黄中抗体的产量、纯度、来源及稳定性.方法应用白色念珠菌作为抗原免疫25周龄Leghorn鸡,通过改良水溶法(WD)提取蛋黄中抗体IgY,双紫外光测定抗体含量,SDS-PAGE电泳检测抗体纯度,Western blot免疫印迹法测定该抗体来源,ELISA检测热处理后的抗体活性.结果抗体含量13 mg/ml蛋黄液,抗体纯度达到95%,Western blot免疫印迹证明该抗体与鸡血清中的IgG具有相同的分子量和抗原性.ELISA检测热处理后的抗体活性,其具有良好的热稳定性.结论鸡蛋黄内含有丰富的抗体,通过WD水溶提取法可得到高产量,高纯度的特异性抗体IgY,证明其来源于鸡血清中的IgG,对热具有高度稳定性.
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鸡抗内毒素卵黄抗体IgY的制备
目的研究分别应用内毒素(LPS)、类脂A(LipidA)和大肠杆菌突变株J5免疫鸡后其蛋黄中抗内毒素抗体IgY的产量、纯度、效价并筛选佳免疫抗原.方法分别应用内毒素(LPS)、类脂A(LipidA)和大肠杆菌J5突变株作为抗原免疫25周龄Leghorn鸡,水溶法(WD)提取蛋黄中抗体IgY,双紫外光测定抗体含量,SDS-PSGE电泳检测抗体纯度,细菌酶联染色和ELISA检测抗体特异性、效价及筛选佳免疫抗原.结果 3种抗内毒素IgY含量和效价分别为14.4 mg/ml和1∶12 800(J5)、10.61 mg/ml和1∶12 800(LPS)、9.26 mg/ml和1∶3 200 (LipidA),抗体纯度均为95%左右.结论大肠杆菌突变株J5和内毒素(LPS)为佳免疫抗原,免疫鸡后其蛋黄中抗内毒素抗体IgY的产量和效价高.
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鸡卵黄特异抗体对人牙菌斑中变形链球菌影响的体内研究
目的探讨鸡卵黄特异抗体(IgY)对健康人牙菌斑中变形链球菌构成比的影响.方法选择志愿受试者24人,随机分为3组:实验组(9人)使用1.5% IgY;阳性对照组(9人)使用1.7 mmol/L洗必太溶液;阴性对照组(6人)使用PBS缓冲生理盐水,各组均于饭后用药含漱1 min,持续3周.分别于用药前、用药中1、2、3周及停药后1、3、5周记录菌斑指数,并收集光滑面集合菌斑样本在MS及MSB培养基中微需氧环境培养,检测菌斑中口腔链球菌群及变形链球菌的菌落形成数,分析各组使用药物前后菌斑中变形链球菌所占比例的变化及变化的延续性.结果应用IgY后,其菌斑指数无明显改变,但牙菌斑中变形链球菌群在口腔链球菌群中的比例明显降低,并且在较长时间内(停药后5周)保持菌斑中变形链球菌的低水平.结论 IgY处理后牙面菌斑的菌群微生态发生改变,为进一步研究牙菌斑微生态防治打下基础.
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人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)的原核表达及其鸡卵黄抗体的制备
目的:原核表达人肝再生磷酸酯酶2(PRL-2)与谷胱甘肽S转移酶(GST)和6个串联组氨酸(6×His)的融合蛋白,并制备GST-PRL-2特异性鸡卵黄抗体.方法:将人PRL-2 cDNA的全长蛋白编码序列,克隆入两种原核表达载体pGEX-4T-2和pET21a中,在大肠杆菌BL21中诱导表达融合蛋白.用Glutathione Sepharose 4B和Ni-NTA agarose亲和柱分别纯化目的蛋白.以纯化的GST-PRL-2融合蛋白免疫产蛋母鸡制备多克隆抗体,应用6×His-PRL-2对抗体进行亲和层析纯化,纯化产物用Western blot进行分析.结果:得到高表达量的融合蛋白,经亲和层析柱纯化后获得较高纯度的GST-PRL-2和6×His PRL-2融合蛋白.以GST-PRL-2融合蛋白免疫鸡得到抗PRL-2的多克隆抗体,Western blot证实,经6×His PRL-2亲和层析纯化的抗体,能够识别6×His-PRL-2和GST-PRL-2融合蛋白,但不同GST蛋白起反应,表明具有较高的特异性.结论:利用原核表达的人PRL-2融合蛋白制备的抗PRL-2多克隆抗体具有较好的特异性,为研究PRL-2蛋白在细胞信号转导过程中的作用提供了重要的技术和材料保障.
