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流体剪切力对骨组织细胞作用的研究进展
骨组织细胞包括成骨细胞、破骨细胞、骨细胞和骨衬细胞.在体内生理条件下,流体剪切力可能是这些细胞受到的主要的力学刺激.近年来对流体剪切力影响骨组织细胞的研究取得了较大的进展,相关研究主要集中在流体剪切力引起骨组织细胞的细胞内信号分子、细胞内钙信号、细胞间隙连接和细胞骨架系统改变这几个方面,同时,流体剪切力会引起骨组织细胞间的相互作用的改变.本文就这些方面的重要研究内容做简要综述.
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ERK5信号通路介导流体剪切力对 MC3 T3-E1 成骨细胞MMPs、TIMPs表达的影响
目的 观察流体剪切力( fluid shear stress, FSS)作用下, MC3T3-E1 成骨细胞中细胞基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases,MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的表达情况,并探讨 ERK5 信号通路在其中的作用.方法 对MC3T3-E1 成骨细胞进行不同的处理,分为正常组、XMD8-92 组、FSS组和FSS+XMD8-92组,对FSS组施加12 dyn /cm2流体剪切力,采用蛋白免疫印迹法分别检测P-ERK5、ERK5、 MMPs和TIMPs 蛋白水平的变化.结果 生理强度(12 dyn/cm2)的流体剪切力作用于MC3T3-E1成骨细胞45 min后能显著上调MMPs的表达,下调TIMPs的表达,但此效应可被 ERK5 高选择性抑制剂 XMD8-92 阻断.结论 ERK5 信号通路调控流体剪切力对成骨细胞MMPs、TIMPs蛋白的表达.
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机械刺激对成骨细胞影响的研究进展
骨质疏松的发病多由于破骨细胞的骨吸收大于成骨细胞的骨形成而造成的一种骨代谢性疾病.骨形成的过程包括骨吸收和骨形成,其中骨形成主要依靠成骨细胞,成骨细胞来源于骨髓的间充质干细胞,由骨髓间充质干细胞定向分化为骨祖细胞,后分化为成骨细胞前体,后分化为成骨细胞.成骨细胞在骨形成中经历成骨细胞的增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡四个阶段.不同的运动方式会对骨骼产生不同的力学刺激,力学刺激会使骨骼产生不同程度的机械应变.大量的研究表明,成骨细胞可感受这种刺激作用,并引起一系列不同变化.本文主要阐述不同形式的机械刺激(微重力、流体剪切力、压应力、牵拉力)对成骨细胞的形态、数量和分化趋势,蛋白以及基因表达水平等方面的影响,为运动疗法对骨质疏松的治疗、预防和促进骨骼发育提供更加可靠的理论依据.
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流体剪切力对破骨细胞的影响
骨组织受到成骨细胞成骨作用和破骨细胞溶骨作用共同影响.与成骨细胞和骨细胞不同,破骨细胞起源于造血干细胞,由单核巨噬细胞发育而来,具有吞噬功能,能对多种刺激因素产生效应,其中机械刺激是始终存在的影响方式.机械刺激诱导的成骨细胞的正性调节对于骨生成、骨修复有至关重要的作用,而破骨细胞在这些方面的效应也十分关键.流体剪切力作为骨组织内机械刺激的一种常见形式,作用于成骨细胞和骨细胞的时候,通过对Ca2、前列腺素、NO、RANKL和OPG等信号因子的影响,表现出介导破骨细胞迁移、分化、吸收和生存维持等现象的功能,这承载了骨代谢必不可少的一部分.同时这些因子相互交错,表现出复杂信息网络及阶段特异性.但总的来说,人们对流体剪切力调节破骨细胞生理及病理功能具体信号传导的了解还不是很深入,需要用更多的研究来阐明流体剪切力和破骨细胞之间的关系.本文就流体剪切力对破骨细胞相关分子信号影响做一综述,简要展示流体剪切力影响破骨细胞的相关机理.
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流体剪切力抑制肿瘤坏死因子α诱导鼠成骨样细胞MC3T3-E1凋亡的实验研究
目的 研究流体剪切力(fluid shear stress,FSS)对肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导鼠成骨样细胞MC3T3-E1凋亡的影响.方法 将MC3T3-E1分为TNF-α干预组(实验组)和无TNF-α干预组(对照组),TNF-α(10 ng/ml)×4 h诱导MC3T3-E1凋亡后,四个实验组分别加载12 dyn/cm2 FSS作用0,15,30,60 min.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、荧光显微镜和流式细胞技术(FΑCS)检测细胞的增殖能力和凋亡,免疫印迹法检测半胱氨酸蛋白激酶9(caspase 9)和凋亡蛋白酶活化因子1(Αpaf-1)蛋白的表达.采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析.结果 TNF-α(10 ng/ml)×4 h能诱导明显的凋亡信号,FSS(12 dyn/cm2)能明显抑制这种凋亡,而且随着刺激时间的增加,从0 min逐渐延长至60 min,细胞活性逐渐增加,凋亡细胞数逐渐减少,实验组与对照组单因素方差分析及各组间LSD两两比较有显著性差异(P＜0.05),同时caspase 9和Αpaf-1蛋白的表达也逐渐增加.结论 生理范围的FSS能够抑制TNF-α诱导的MC3T3-E1细胞的凋亡,作为线粒体通路的关键蛋白,caspase 9和Αpaf-1在凋亡时增加而FSS后表达减少,说明FSS抑制这种凋亡至少部分是减弱了凋亡的线粒体通路.
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流体剪切力对MLO-Y4骨细胞骨性标志物表达的影响
目的 通过研究MLO-Y4骨细胞受流体剪切力作用前后骨性标志物在mRNA水平的表达变化,探讨机械力影响骨组织代谢中骨细胞的作用.方法 以小鼠成骨细胞(MOB)为参照,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MLO-Y4细胞在体外培养条件下,以及受流体剪切力作用0.5 h,1 h,2 h,4 h,6 h,12 h,24 h后骨性标志物在mRNA水平的表达特征和变化.结果 以MOB为参照,在mRNA水平,体外培养条件下MLO-Y4细胞骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)和骨桥蛋白(OPN)高表达;破骨细胞分化因子(RANKL)、骨保护因子(OPG)低表达,但RANKL/OPG比值明显高于MOB.受流体剪切力作用后,MLO-Y4细胞ALP、OCN表达降低;RANKL和OPN表达增加;OPG随加力时间也有一定变化.结论 MLO-Y4细胞具有分化终末骨细胞的特点;流体剪切力作用后,RANKL/OPG比值以及ALP、OCN和OPN等骨性标志物的表达发生变化,为其参与机械力信号到生物信号的传导过程提供了间接证据.
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雌激素与流体剪切力对成骨细胞DNA合成的影响
骨质疏松是中老年人骨代谢的主要特征,雌激素缺乏是原发性骨质疏松症的主要原因之一.已有研究表明,雌激素能促进成骨细胞的生长分化,从而影响机体骨代谢.活体细胞对外力的反应是由于外力导致组织间液流动发生改变,从而被细胞感知.本项研究选择流体剪切力作为细胞加力方式,观察雌激素与流体剪切力对体外培养的成骨细胞增殖与 DNA 合成的影响,探讨雌激素与机械力对成骨细胞的影响.
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细胞骨架完整性对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达的影响
目的 研究细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白表达中的作用,为进一步探索骨组织力传导机制提供依据.方法 原代培养BALB/c小鼠成骨细胞,将原代培养的成骨细胞分为对照组和细胞松弛素 D组,细胞松弛素D组使用细胞松弛素D破坏细胞骨架.每组一半细胞加载1.2 Pa的流体剪切力,另一半不加载.分别用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和免疫荧光检测c-fos基因mRNA和蛋白、细胞骨架蛋白的表达水平,并对结果进行双因素方差分析和成组t检验.结果 无论是对照组还是细胞松弛素D组,流体剪切力加载均可使成骨细胞c-fos基因mRNA相对水平(分别为0.1637±0.0303和0.0104±0.0070)和蛋白荧光强度(分别为177.14±9.37和150.95 ±6.17)升高,与未加载流体剪切力的对照组和细胞松弛素D组细胞(mRNA相对水平分别为0.0057±0.0021和0.0032±0.0014,蛋白荧光强度分别为117.96±4.11和119.77±5.19)相比,差异均有统计学意义(P＜0.05).流体剪切力加载下,细胞松弛素D组细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达均低于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 细胞松弛素D对流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因mRNA和蛋白的表达起拮抗作用.保持细胞骨架的完整性是流体剪切力诱导成骨细胞c-fos基因表达过程中的重要条件.
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不同加载时间流体剪切力对成骨细胞Ⅰ型胶原合成及碱性磷酸酶活性的影响
目的 探讨不同加载时间流体剪切力对成骨细胞Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)转录及分泌的影响.方法 通过自行构建的平行平板流体加载装置,对MC3T3-E1细胞施加单次12 dyn/cm2流体剪切力0、0.5、1、2及4h;利用荧光定量聚合酶链反应(PCR)及免疫组化染色检测COL-Ⅰ转录及分泌情况;并检测细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性.结果 成骨细胞经流体剪切力加载12 h,增加COL-Ⅰ转录;24 h后,增加COL-Ⅰ的合成及分泌;48 h后,提高ALP的活性;其中细胞对12 dyn/cm2流体剪切力1h的加载响应明显.结论 不同加载时间的12 dyn/cm2流体剪切力能够提高MC3T3-E1前体成骨细胞COL-Ⅰ的转录分泌及ALP活性,但加载1h合适.
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细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用
目的 探讨细胞骨架完整性在流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达中的作用.方法 原代培养BALB/c小鼠颅骨成骨细胞,采用细胞松弛素D(CD)破坏细胞骨架完整性;以12 dyne/cm2的流体剪切力对成骨细胞加载1.5 h;分别应用实时荧光定量巢式PCR和免疫荧光的方法 检测COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平,并对结果 进行双因素方差分析.结果 采用CD破坏细胞骨架完整性,可以对流体剪切力诱导成骨细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达起拮抗作用(P ＜ 0.05);在无流体剪切力加载条件下,CD处理对COX-2 mRNA和蛋白的表达水平无显著影响(P ＞ 0.05);流体剪切力加载1.5 h能使成骨细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P ＜ 0.05);CD处理可显著降低流体剪切力诱导成骨细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达水平(P ＜ 0.05).结论 保持细胞骨架完整性是流体剪切力诱导成骨细胞COX-2基因表达过程中所必需的.
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RNAi沉默LIMK2基因对成骨细胞COX-2基因力学敏感性的影响
目的：采用RNAi技术沉默LIMK2基因来抑制细胞骨架改建，观察其对流体剪切力下成骨细胞COX-2基因力学敏感性的影响。方法；RNAi技术沉默原代小鼠成骨细胞LIMK2基因来抑制细胞骨架改建，分别用实时荧光定量巢式PCR和免疫荧光的方法检测流体剪切力下COX-2基因mRNA和蛋白的表达水平。结果：RNAi抑制细胞骨架改建可以促进流体剪切力诱导的成骨细胞COX-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论：采用RNAi技术抑制细胞骨架改建，可以提高流体剪切力作用下成骨细胞COX-2基因的力学敏感性。
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流体细胞培养系统对三维培养的成骨细胞的影响
设计制作流体细胞培养系统并研究流体剪切力对三维培养成骨细胞黏附增殖的影响.方法:取SD 乳鼠颅盖骨,采用组织块法获取成骨细胞,接种于部分脱蛋白天然牛骨支架,将实验组支架置于自制的细胞培养系统中,流速设置为0.3ml/min 作用1d 后增加流速至1ml/min,对照组支架静置培养.4d 和8d 后收集实验组和对照组样本,SEM 观察细胞在支架表面和内部的黏附、生长情况.SEM 观察显示:流体剪切力作用下的细胞增殖分化较快,较早地向支架内部爬行生长而且细胞长轴明显沿加力方向延长.本实验成功制作了流体剪切力细胞培养系统并在体外证实流体剪切力有利于细胞在支架上黏附和增殖.
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机械力对成骨细胞增殖和分化的影响研究进展
成骨细胞是骨形成与生长的重要细胞,负责骨基质的合成、分泌和矿化.机械力的刺激作用对成骨细胞生长、发育、修复和凋亡发挥着重要作用.体内的力学环境比较复杂,用体外给予单种力学加载的方法可有效的消除其他因素的干扰,可以通过控制加载力的方式、大小、频率、时间等来研究机械力刺激对成骨细胞增殖和分化的影响.体外加载力的方式大概包括流体剪切力(fluid shearstress,FSS)、离心力(centrifugation)、机械压力(mechanical stress)、机械张力(mechanical strain)和机械振动(mechanical vibration)等.本文通过近年来国内外有关机械力对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响的研究进行综述.
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细胞膜脂筏结构蛋白质组与血管内皮细胞功能调控
动脉粥样硬化发病起始于内皮细胞功能紊乱，在动脉粥样硬化病因学方面的工作集中在脂质代谢和炎症反应两个方面。内皮细胞膜表面脂筏结构参与到内皮细胞许多重要的生理功能中：感受细胞内胆固醇水平并参与胆固醇代谢，感受并传导血流剪切力信号，为许多信号分子相互作用提供平台。本文主要针对细胞膜脂筏结构蛋白质组与血管内皮细胞功能调控进行综述。
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体外培养人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的流体剪切应力参数
目的:流体剪切力是骨骼组织中骨骼细胞所感受到的主要应力刺激,可促进骨骼细胞的增殖、分化及保持细胞正常的生理功能.应用流体剪切力刺激体外培养的人骨髓间充质干细胞,观察其向成骨细胞分化的可行性.方法:实验于2004-04/12在第三军医大学西南医院完成,骨髓来源于正常志愿献髓者.进行人骨髓间充质干细胞的分离培养,实验组应用平行平板流动腔对自愿捐献的人骨髓间充质干细胞给予强度为0.3 Pa的流体剪切力刺激30 min,对照组不加此干预,两组物理环境相同.应用流式细胞仪检测细胞周期,应用透射电镜观察细胞超微结构,检测细胞内碱性磷酸酶含量.评估其向成骨细胞分化和具备功能的特征.放免法检测培养上清液骨钙素含量.评估其是否向成骨细胞成熟晚期分化.并与静态培养对照组作对比.结果:①实验组经流体剪切力作用后,细胞胞体变大,突起较多,多角形细胞较对照组增多;透射电镜观察可见细胞胞浆丰富、核浆比例小,有较多的内质网,高尔基体发达,核仁明显,呈成熟细胞表现.②实验组细胞S期(DNA合成期)比例较对照组明显增高[(13.53±1.47)%,(7.56±2.54)%,P＜0.01].③实验组细胞内碱性磷酸酶含量第9天开始增高,且随时间延长,增高速度加快.④第12天及第24天检测的上清液骨钙素含量两组无明显差别(t=0.263,-0.406,P＞0.05).结论:本实验发现强度为0.3 Pa作用30 min的流体剪切力可以使人骨髓间充质干细胞早期的细胞内碱性磷酸酶含量增高,细胞开始向成骨细胞分化,但未能促使晚期的骨钙素表达升高,说明此强度的流体剪切力不能成功促进人骨髓间充质干细胞终实现向成骨方向分化.需要继续探索能够促进人骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的流体剪切力的更有效的参数.
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流体剪切力作用下阿司匹林对不同钛表面MG-63细胞增殖活性的影响
背景:近有国内外临床试验、动物实验和体外细胞学实验证明,适宜浓度阿司匹林能上调成骨细胞的增殖及成骨功能.目的:探讨流体剪切力作用下不同浓度阿司匹林对成骨细胞增殖的影响.方法:①采用含体积分数10％胎牛血清与不同浓度阿司匹林(0,0.023,0.046,0.062 5,0.125,0.25,0.5,1.0,2.0,4.0 mmol/L)的DMEM低糖培养液培养MG-63人成骨样细胞,1-7 d后,MTS法检测细胞增殖;②将MG-63人成骨样细胞分别接种于高度抛光钛板、喷砂酸碱处理钛板及光滑载玻片上,培养1d后,再分别以含不同浓度阿司匹林(0,0.5 mmol/L)的培养液培养3d,施加流体剪切力,加力0,0.5,1,2,4h后,MTS法检测细胞增殖.结果与结论:①不同浓度阿司匹林对细胞增殖的作用:培养1-3 d时,0.023,0.046,0.062 5,0.5 mmol/L的阿司匹林可促进MG-63人成骨样细胞的增殖;培养1-7 d,1,2,4 mmol/L的阿司匹林抑制MG-63人成骨样细胞的增殖;②流体剪切力作用下阿司匹林对细胞增殖的作用:单因素方差分析结果显示,阿司匹林药物处理因素对细胞增殖影响的差异有统计学意义(F=8.349,P=0.004),0.5 mmol/L阿司匹林可降低MG-63人成骨样细胞的增殖活性;材料表面处理对细胞增殖影响的差异无统计学意义(F=2.826,P=0.064);不同流体剪切力加载时间对细胞增殖影响的差异无统计学意义(F=0.893,P=0.406);③流体剪切力下0.5 mmol/L阿司匹林对细胞增殖的作用:材料表面处理对细胞增殖影响的差异无统计学意义(F=1.803,P=0.171);0.5 mmol/L阿司匹林可显著抑制玻片组MG-63人成骨样细胞的增殖(P=0.003),对高度抛光钛板及喷砂酸碱处理钛板组MG-63人成骨样细胞增殖无显著抑制作用(P=0.891,P=0.051):④结果表明:不同浓度阿司匹林对MG-63人成骨样细胞增殖有明确的影响作用,且有浓度依赖性;不同钛表面处理可降低阿司匹林对MG-63人成骨样细胞增殖的影响作用.
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流体剪切力对人牙周膜细胞LEF-1 mRNA表达影响研究
目的 探讨人牙周膜细胞在流体剪切力作用下淋巴样增强因子-1 (lymphoid enhancer factor-1,LEF-1)mRNA的表达.方法 对人牙周膜细胞进行原代培养;通过流体剪切力加力系统对人牙周膜细胞施加1.2 Pa的流体剪切力,作用O、0.5、2、4、8h后,用RT-PCR方法检测细胞受力前后LEF-1 mRNA的表达变化.结果 人牙周膜细胞在1.2 Pa的流体剪切力作用8h后,LEF-1 mRNA的表达升高.结论 流体剪切力刺激活化了人牙周膜细胞中LEF-1的转录,LEF-1mRNA的表达升高,可能是在剪切应力作用下Wnt信号通路的应答反应.
关键词： 牙周膜细胞 LEF-1 mRNA 流体剪切力 -
黏着斑-细胞骨架系统介导流体剪切力力转导研究进展
黏着斑是将细胞外基质与细胞骨架联系起来的多蛋白聚集体,在力信号转化为细胞内化学信号、继而引发相应的生理或病理反应过程中发挥着重要作用.本文以黏着斑-细胞骨架系统为重点,总结了黏着斑介导的流体剪切力的力转导过程以及细胞骨架在此过程中的关键作用,介绍了黏着斑中参与胞内信号转导的重要蛋白,并讨论了黏着斑与其他力转导途径的联系,为更好理解剪切力和相关疾病间的关联以及临床药物的研发和疾病的治疗奠定了理论基础.
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流体剪切力在骨生长、重建中的重要作用
骨组织具有优化结构,是一个典型的结构-功能受生物力学控制的例子.力学因素在骨的生长、重建和成形中起着十分重要的作用,但力学刺激的本质形式至今无法确认.骨组织存在多孔结构,力学负荷引起的变形会促使流体流动对骨细胞产生作用,离体实验也证实骨细胞能对流体产生响应,因此流体剪切力是研究骨组织受力学调控时考虑的一个重要方面.现有的研究主要体现在流体的有效作用形式,细胞的生物学反应,以及流体剪切力在细胞中的力学转导;各个方面的研究都提示,流体剪切力至少部分的参与了骨组织内的力转导.作者就这方面的研究进展作一综述.
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流体剪切力作用下无间隙连接成骨细胞阵列内的钙响应
目的 研究间隙连接和ATP在力致胞间钙传递过程中各自的作用.方法 首先应用微模式化方法建立无间隙连接的成骨细胞阵列,再利用流动腔对细胞施加流体剪切力,观察并分析细胞的钙响应特征参数.结果 细胞间无物理连接时,仍会出现多个钙响应峰,但第1峰的响应时间与有间隙连接时相比明显加长.除去胞外或胞内钙时,只有约40％的细胞发生钙响应,且单峰与多峰约各占一半.阻断胞外ATP通路后,只有约20％的细胞有钙响应,且大多为单峰.结论 细胞间的间隙连接不存在时,ATP是介导细胞间钙传递的主要途径,说明间隙连接不是细胞间力致钙响应的必需途径.
