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Jagged1蛋白在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达差异
目的 Jagged1蛋白在大鼠肌源性干细胞(MDSCs)体外增殖分化为神经样细胞过程中的表达差异研究.方法大鼠乳鼠骨骼肌消化后体外培养增殖,第5代传代后细胞分为2组:对照组完全培养基培养,诱导组加入诱导剂诱导.6 d后观察2组细胞的形态变化,并进行NSE免疫细胞化学鉴定.然后通过免疫荧光观察Jagged1蛋白的表达差异.结果诱导组细胞NSE染色阳性,免疫荧光结果显示对照组Jagged1蛋白表达阳性,实验组基本不表达.结论大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Jagged1蛋白表达存在明显差异.
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当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响
目的:观察当归补血汤对体外造血微环境中小鼠肌源性干细胞分化的影响.方法:分离小鼠肌源性干细胞并培养鉴定.制备含有不同剂量当归补血汤的大鼠载药血清及对应剂量的骨髓基质细胞条件培养基.将肌源性干细胞随机分为8组:正常大鼠血清组、当归补血汤载药血清1～3组、正常大鼠血清条件培养基组、条件培养基1～3组,免疫组化法检测CD45的表达情况.结果:培养的肌源性干细胞呈desmin染色阳性；培养3天时载药血清3组、条件培养基两组及3组阳性细胞与正常大鼠血清组之间相比CD45表达量有显著性差异；随当归补血汤载药血清浓度增大CD45表达量增多,10倍剂量载药血清作用效果佳,条件培养基也呈同样的变化趋势,经10倍剂量载药血清干预的条件培养基作用效果显著.结论:当归补血汤载药血清及含载药血清的条件培养基可促进肌源性干细胞向造血细胞方向分化.
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BMP-2诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞的体外实验研究
目的 体外定向诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)向软骨细胞转化,并对诱导细胞进行鉴定.方法 用差速贴壁的方法对SD大鼠MDSCs进行分离和培养.用骨形态发生蛋白2(BMP2)将MDSCs进行诱导分化,9 d后取出标本,行甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达.RT-PCR检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖(aggrecan)的mRNA表达.结果 5 d后镜下见细胞形态由梭形向多边多角形转化.9 d后诱导组甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化检测阳性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.结论 BMP-2可诱导MDSC向软骨细胞转化.
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透明质酸凝胶中肌源性干细胞与透明软骨联合培养的实验研究
目的 探讨肌源性干细胞与软骨细胞混和培养体外成软骨的可行性.方法 分离培养、扩增传代兔MDSCs及关节软骨细胞,二者按一定比例混和,6x10<'10>/L密度接种于5%浓度的透明质酸凝胶为共培养组,以相同密度的单纯MDSCs和单纯软骨细胞作为阴性与阳性对照.倒置相差显微镜下观察,10 d后行甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化学检测,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan的mRNA表达.结果 5 d后镜下见共培养组MDSCs形态由梭形向多边多角形转化,10 d后细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学检测与阳性对照组相同,RT-PCR检测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.阴性对照组在体外培养过程中未分化为软骨细胞.结论 软骨微环境在MDSCs成软骨分化过程中具有重要作用,软骨细胞能有效地诱导MDSCs向软骨样细胞分化,透明质酸凝胶可以作为软骨组织工程的良好载体.
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新生小鼠肌源性干细胞的生物学特性及表型研究
目的 通过体外新生小鼠肌源性干细胞(MDSCs)的培养,观察鼠肌源干细胞的生物学特性及表型.方法 采用胶原酶Ⅺ和胰蛋白酶分步消化肌肉, 后采用差速贴壁分离技术纯化获得MDSCs.用倒置显微镜观察细胞形态,测定生长曲线,分析MDSCs的增殖能力,采用Sca-1、CD34 和Desmin免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定,初步确定细胞表型.结果 经过两步消化和差速贴壁后,成功培养出高纯度的肌源性干细胞,该细胞呈Sca-1、CD34和Desmin阳性.结论 可通过体外原代培养获得高纯度的肌源性干细胞,细胞具有良好的增殖能力,是适用于组织工程和基因治疗研究的一种新型种子细胞.
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人肌源干细胞体外成骨作用的实验研究
目的 探讨人肌源性干细胞(MDSCs)的分离、培养,鉴定及体外成骨作用,为临床应用提供实验依据.方法 采用消化法分离 MDSCs,应用差速贴壁法纯化干细胞,免疫细胞化学染色对细胞鏊定,MDSCs 在骨形态发生蛋白-2(BMP-2)诱导分化后,检测其碱性磷酸酶、骨钙素.结果 成功获得高纯度的 MDSCs,免疫组织化学方法能够有效鉴定 MDSCs,BMP-2 诱导 MDSCs 后能够合成碱性磷酸酶、骨钙素.结论 可通过体外原代培养获得高纯度 MDSCs,其具有干细胞特征,并能够转化为骨系细胞,发挥成骨作用,为组织工程的临床应用提供种子细胞.
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慢病毒介导IGF-1基因修饰肌源性干细胞移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的实验研究
目的:探讨IGF-1基因修饰的肌源性干细胞(MDSCs)移植治疗雌性压力性尿失禁大鼠的作用及可能机制.方法:尿失禁大鼠随机分对照组即MDSCs移植组(n=15)和治疗组即IGF-1基因修饰的MDSCs移植组(n=15),以1×106个MDSCs/只注入尿道距膀胱约0.5cm处,评价注射后尿道闭合功能情况、VEGF的表达情况及移植细胞存活情况.结果:与对照组比较,治疗组膀胱大容量及腹压漏尿点压(ALPP)均升高,但差异无统计学意义(P>0.05);细胞存活数、VEGF蛋白表达量显著升高,差异有统计学意义(P<0.05).结论:IGF-1基因修饰的MDSCs增强了其在移植环境中的生存能力,并通过其旁分泌功能,可能为治疗压力性尿失禁提供了一种新的方法.
关键词： 胰岛素样生长因子-1 肌源性干细胞 压力性尿失禁 生存能力 -
补阳还五汤对大鼠肌源性干细胞体外生长分化的影响
目的 观察补阳还五汤含药血清对体外培养的大鼠乳鼠肌源性干细胞生长及分化的影响.方法 取3d内大鼠乳鼠骨骼肌,分离纯化肌源性干细胞,分别接种在含对照血清培养基和含药血清培养基的培养孔内,观察细胞形态变化;通过免疫荧光法和Western blot对2组细胞的神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达进行对比分析.结果 药物血清组中的细胞可见多边形改变类似神经样突起,而对照组细胞呈纺锤状;药物血清组中细胞的NSE和GFAP表达均明显高于对照组(P＜0.05).结论 补阳还五汤含药血清可促进肌源性干细胞向神经元样细胞分化.
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三维环境下肌源性干细胞分化为胰岛样细胞团
目的:运用三维细胞培养模型研究细胞外微环境对肌源性干细胞分化为胰岛样细胞的作用.方法:用差速贴壁的方法对SD大鼠肌源性干细胞进行分离和培养,将细胞分为胶原支架化学诱导剂组,化学诱导剂组,空白组.分别观察诱导后细胞的生长形态,采用双巯腙DTZ染色鉴定胰岛素分泌细胞,细胞免疫化学检测胰岛相关蛋白,RT-PCR方法检测诱导后细胞的相关基因表达情况,葡萄糖刺激实验检测胰岛样细胞成熟度.结果:在普通光镜下,胶原支架化学诱导剂组中诱导的胰岛样细胞团体积比化学诱导剂组大得多；双巯腙DTZ染色结果显示胶原支架化学诱导剂组比化学诱导剂组能诱导更多的胰岛样细胞；细胞免疫化学检测胶原支架化学诱导剂组诱导的胰岛样细胞更类似于成年大鼠胰岛组织；RT-PCR方法检测胶原支架化学诱导剂组表达胰岛相关基因比化学诱导剂组高.结论:三维环境下肌源性干细胞可诱导分化为胰岛样细胞,并且大鼠肌源性细胞可大量快速分化为更成熟的胰岛样细胞.
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Detla1基因在肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中的表达
目的:研究Detla1基因在大鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞过程中的表达.方法:大鼠乳鼠骨骼肌体外培养增殖,分为对照组完全培养基培养,实验组加入诱导剂培养.通过RT-PCR、免疫荧光和免疫印迹法观察Detla1基因存诱导组和对照组的表达差异.结果:对照组Detla1基因表达强阳性,实验组基本不表达.结论:大鼠肌源性干细胞分化为神经样细胞过程中Detla1基因表达减低.
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大鼠乳鼠肌源性干细胞体外诱导分化为神经样细胞
目的:探讨神经生长因子(NGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导大鼠乳鼠肌源性干细胞(MDSCs)分化为神经样细胞的可行性.方法:取SD大鼠乳鼠骨骼肌,差速贴壁至第5代时培养液中加入诱导培养基培养,行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学鉴定和RT-PCR分析.结果:分化后细胞NSE染色阳性,RT-PCR结果显示,诱导后MDSCs样品中检测到NSE、GFAP特异性条带.结论:在一定条件下NGF和bFGF联合诱导法可以诱导MDSCs分化为神经样细胞.
关键词： 肌源性干细胞 神经样细胞 碱性成纤维细胞生长因子 神经生长因子 -
软骨细胞培养液诱导肌源性干细胞转化为软骨样细胞
测Ⅱ型胶原和aggrecan mRNA呈阳性表达.结论:软骨细胞培养液可诱导MDSC向软骨细胞转化.
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大鼠胰腺提取液体外诱导肌源性干细胞分化为胰岛素分泌细胞
目的:探讨大鼠胰腺提取液(RPE)对大鼠肌源性干细胞(MDSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞的作用.方法:RPE诱导MDSCs通过形态学观察、双硫腙(DTZ)染色、免疫细胞化学显色、葡萄糖刺激实验和RT-PCR,对诱导细胞进行体外结构和功能鉴定.结果:RPE诱导后第5日有胰岛样结构出现;免疫细胞化学显示,诱导后第12日细胞团表达胰岛素、胰高血糖素,而未诱导组细胞不表达上述蛋白;RT-PCR结果表明.诱导后第6日检测到PDX-1的表达,诱导后第12日检测到胰岛素1、胰岛素2、胰高血糖素和葡萄糖转运体2基因的表达.结论:体外经RPE诱导,大鼠肌源性干细胞可定向分化为胰岛素分泌细胞.
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白血病抑制因子及神经生长因子联合诱导大鼠肌源性干细胞向神经元样细胞分化
目的:探讨白血病抑制因子(LIF)和神经生长因子(NGF)联合诱导大鼠肌源性干细胞分化为神经细胞的可能性和条件.方法:从大鼠乳鼠骨骼肌中分离培养肌源性干细胞,LIF和NGF进行分化诱导,以MEM培养基同等条件培养作对照,相差显微镜下观察细胞形态变化.免疫组织化学显色观察神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,测定细胞转化率.结果:肌源性干细胞经过LIF和NGF诱导12 h后,部分细胞分化,类似神经细胞;免疫组织化学显色观察神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白呈强阳性.结论:LIF和NGF联合应用能将肌源性干细胞诱导成神经元样细胞,为细胞移植治疗脊髓损伤提供一种高效种子细胞生产方法.
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绿色荧光蛋白腺病毒表达载体在大鼠肌源性干细胞标记中的应用
目的:对大鼠肌源性干细胞转染携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体,为进一步行标记细胞移植治疗实验奠定基础.方法:复苏并培养人胚胎肾293细胞,进行包装重组及大规模扩增腺病毒;原代培养大鼠肌源性干细胞并进行GFP基因转染,荧光显微镜观察转染情况并计算转染率.结果:人胚胎肾293细胞在普通培养条件下生长良好,加入Ad-GFP病毒液后48 h荧光显微镜观察绝大多数细胞呈悬浮状态,带有较强的绿色荧光;转染肌源性干细胞后呈Desmin免疫组织化学显色阳性;48 h荧光转染率为83.14%,4 d为78.35%,8 d为75.12%.结论:采用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒表达载体标记肌源性干细胞的方法安全可靠、简便有效,且能保持肌源性干细胞原有生物学特性.
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共培养条件下大脑皮层神经元诱导肌源性干细胞成神经元样细胞
目的:研究使用共培养系统将肌源性干细胞(MDSCs)诱导为神经元样细胞的可行性及机制.方法:分离新生SD大鼠的MDSCs及皮层神经元,以叔丁基过氧化氢(终浓度为200μmol/L)损伤神经元,构建氧化应激损伤的神经元模型.当MDSCs差速贴壁至第5代时,将其随机分为MDSCs和损伤的神经元置于共培养系统中培养(损伤组)、MDSCs和正常神经元共培养(未损伤组)以及MDSCs置于共培养系统中单独培养(MDSCs组),培养7d后用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫细胞化学法鉴定诱导的结果,并用大鼠脑源性神经营养因子(BDNF) ELISA试剂盒检测不同时间点各组培养液中该因子的分泌情况.结果:共培养7d后检测到损伤组与未损伤组均有部分MDSCs分化为表达NSE的神经元样细胞,前者分化率高于后者,MDSCs组未见有细胞分化为神经元样细胞.第2天损伤组BDNF的分泌量高于未损伤组,同时,损伤组第2天BDNF的分泌量高于第4天和第6天的分泌量.在不同时间点损伤组与未损伤组培养液中BDNF的分泌量均高于MDSCs组.结论:在共培养条件下,大鼠皮层神经元可诱导MDSCs为神经元样细胞,这与神经元分泌的BDNF有着重要联系,MDSCs也可分泌BDNF.
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丹参抑制骨骼肌肌源性干细胞合成胶原蛋白的机制研究
目的 研究丹参抑制体外骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)合成胶原纤维的机制.方法 采用差速贴壁法分离大鼠骨骼肌MDSCs,利用TGF-β1诱导MDSCs表达胶原纤维,观察丹参对细胞的作用.将体外培养的细胞分为四组,A组:对照组；B组:150 mg/L丹参组；C组:10 μg/L TGF-β1组；D组:10μg/LTGF-β1+ 150 mg/L丹参组.利用免疫细胞化学方法,RT-PCR及Western Blot检测MDSCs中Smad3和COLⅠ表达.结果 在体外,TGF-β1能加强Smad3表达,诱导MDSCs表达胶原蛋白,丹参能拮抗TGF-β1的作用,降低细胞Smad3和COL Ⅰ的表达和合成水平.结论 丹参可以抑制MDSCs表达和合成细胞外基质,其机制是通过干预TGF-β1-Smad3信号通路,抑制MDSCs分化,从而降低细胞合成和分泌胶原纤维.
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转化生长因子-β1促进失神经骨骼肌肌源性干细胞表达胶原纤维的研究
目的 探讨转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对体外失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)表达和合成细胞外基质的影响.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,培养基中加入TGF-β1.将体外培养的细胞分为2组:A组,对照组；B组,10μg/L TGF-β1.在相差显微镜下观察细胞生长情况,利用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测MDSCs中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的表达和合成.结果 在体外,失神经骨骼肌MDSCs低表达和合成COL-Ⅰ和COL-Ⅲ.TGF-β1作用24h后,失神经骨骼肌MDSCs中COL-Ⅰ和COL-ⅢmRNA的表达开始增高,48h时COL-ⅠmRNA表达达峰值,之后一直持续高表达,COL-ⅢmRNA表达缓慢增高,在5d时达高峰；3d时COL-Ⅰ的合成升高显著,5d时COL-Ⅲ的合成增加明显.结论 TGF-β1能加强失神经骨骼肌MDSCs合成和分泌细胞外基质,促进失神经骨骼肌纤维化.
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三磷酸腺苷促进肌源性干细胞增殖的作用及机制研究
目的 研究三磷酸腺苷(ATP)促进肌源性干细胞(MDSCs)增殖的作用机制.方法 采用差速贴壁法分离出小鼠MDSCs,将细胞分为两组:实验组(100 μmol/L ATP)和对照组,观察MDSCs的生长情况,用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测MDSCs中ATP受体的表达.结果 ATP作用3d后,实验组的细胞数显著多于对照组.与对照组相比,实验组的G1％(处于G1期的细胞百分率)降低,S％(处于S期的细胞百分率)和PrI值(增殖指数)升高.实验组MDSCs各亚周期(G1期、S期和G2M期)时间分别为21.5 h、4.4h和10.8 h,对照组MDSCs各亚周期时间分别为27.1h、9.6h和13.5 h.与对照组相比,实验组细胞G1期和S期明显缩短.ATP作用后,小鼠MDSCs中P2Y1受体表达显著升高,在3d时达到高水平,之后开始下降,但仍然维持高水平.结论 ATP上调MSCs中P2Y1受体的表达,缩短G1期和S期,促使细胞从G1期进入S期,从而刺激MDSCs增殖.
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CTGF shRNA表达质粒的构建及对大鼠肌源性干细胞CTGF表达的影响
目的 观察针对结缔组织生长因子(CTGF)所构建的短发卡RNA(shRNA)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导大鼠肌源性干细胞(MDSCs)表达CTGF的影响.方法 针对CTGF mRNA上的序列,体外合成表达shRNA的DNA质粒载体pGenesil-3-shRNA并行测序鉴定;从新生SD大鼠骨骼肌中分离培养MDSCs并鉴定.实验分成对照组(MDSCs+TGF-β1培养),实验组(MDSCs+ TGF-β1+pGenesil-3-shRNA培养).观察shRNA质粒转染结果.利用Real-Time PCR及Western Blot检测CTGF mRNA和CTGF蛋白表达.结果 正确构建了靶向CTG,F基因的质粒载体pCenesil-3-shCTGF;大鼠MDSCs 48 h、72h和96h时实验组的CTGF mRNA及蛋白质水平均低于对照组(P＜0.05).结论 针对CTGF构建的pGenesil-3-shCTGF能够转染MDSCs,并在48h、72h和96h时能明显降低TGF-β1刺激MDSCs所产生CTGF的表达.
