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Olig对少突胶质细胞介导脱髓鞘大鼠髓鞘再生的影响
目的 探讨Olig在少突胶质细胞介导的脱髓鞘大鼠髓鞘再生中的作用.方法 40只健康Wistar大鼠,随机分成正常组、模型对照组、模型组、实验组,用形态学观察和免疫组织化学检测Oligl和Olig2的表达.结果 正常组Oligl位于少突胶质细胞的胞质,模型组胞核表达明显增多,实验组Oligl又重新转移至胞质;正常组Olig2表达位于胞核,模型组中有少量表达于胞质.结论 在Olig1和Olig2同时缺失时,导致全脑不能形成少突胶质细胞,严重影响髓鞘的再生.
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Olig基因与中枢神经系统疾病的研究进展
Olig1和Olig2是Olig家族主要成员,近年来研究发现Olig1和Olig2与脱髓鞘疾病、胶质瘤、缺血缺氧性脑损伤等疾病的发生及恢复密切相关,它们不仅参与了少突胶质早期定向分化和晚期成熟分化的转录调控过程,而且对中枢神经系统的正常发育及髓鞘的形成有着至关重要的作用.有关Olig基因与中枢神经系统疾病关系的研究成为国内外研究的热点.
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过表达Olig2和Nkx2.2人胚胎干细胞系的建立
目的:建立过表达Olig2和Nkx2.2的人胚胎干细胞(hESCs)系.方法:利用RT-PCR从鼠N2A细胞克隆出Olig2和Nkx2.2的ORF片段,将Olig2和Nkx2.2基因编码序列分别和带有HA及Flag的载体连接,构建Olig2-HA和Nkx2.2-Flag重组载体.将构建的载体分别与2种病毒辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,制备并浓缩Olig2-HA和Nkx2.2-Flag慢病毒颗粒,感染hESCs,嘌呤霉素筛选的阳性克隆传代培养10代后鉴定细胞内Olig2和Nkx2.2的表达.结果:PCR扩增得到含Olig2和Nkx2.2基因编码序列的特异性条带;携带有Olig2和Nkx2.2基因的慢病毒能够同时感染hESCs,表达Olig2-HA和Nkx2.2-Flag融合蛋白,并稳定遗传.结论:成功构建了同时过表达Olig2和Nkx2.2的人胚胎干细胞系.
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Oligodendrocytes in Mouse Corpus Callosum are Coupled Via Gap Junction Channels Formedby Connexin47 and Connexin32
已有的超微结构研究显示,白质中的少突胶质细胞和星形胶质细胞之间存在缝隙连接,但少突胶质细胞之间不存在缝隙连接,虽然体外培养的少突胶质细胞可形成功能性缝隙连接.本文研究新生小鼠胼胝体急性脑片中的少突胶质细胞的功能性连接.以全细胞膜片钳技术用生物胞素(一种可渗透的缝隙连接示踪剂)标记少突胶质细胞.平均61个细胞为链霉亲和素-Cy3标记的生物胞素阳性.约77%的连结细胞表达少突胶质细胞标志蛋白CNPase阳性染色,9%表达星形胶质细胞标志蛋白GFAP阳性,14%为CNPase和GFAP阴性.后者的大部分表达Olig2和一些NG2(少突胶质细胞前体细胞的标志物).少突胶质细胞表达Cx47、Cx32和Cx29,星形胶质细胞表达Cx43和Cx30.在Cx47敲除小鼠中,连结细胞的数量减少80%.单独删除Cx32或Cx29并不能显著减少连结细胞的数量,但Cx32/Cx47双缺陷小鼠中没有观察到相互连结的细胞.Cx47敲除完全消除了少突胶质细胞与星形胶质细胞间的耦联.在Cx43敲除动物中,少突胶质细胞-星形胶质细胞间连接仍然存在,但与少突胶质细胞前体细胞间的耦联没有被观察到.在Cx43/Cx30双敲除小鼠中,少突胶质细胞-星形胶质细胞连接几乎不存在.解开连结的少突胶质细胞显示为较高的膜输入电阻.本文认为,白质中的少突胶质细胞依靠Cx47和Cx32的表达形成功能性的合胞体,而星形胶质蛋白缝隙连接蛋白的表达能提升此网络的大小.
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NG2 Cell Response in the CNP-EGFP Mouse After Contusive Spinal Cord Injury
成年动物中枢神经系统中的NG2细胞具有异质性.脊髓损伤(SCI)后.具有少突胶质前体细胞(OPCs)功能的NG2细胞亚型如何产生反应性变化及对其正常的发育过程有何影响目前还不清楚.本文采用少突胶质细胞系细胞表达EGFP的CNP-EGFP小鼠,研究正常和SCI后的NG2细胞的特征.在正常小鼠的白质中,对EGFP+NG2+双极细胞和EGFPnegNG2+多极细胞进行鉴别.SCI后,白质损伤边缘区中的EGFP+NG2+细胞3 d增殖达高峰,损伤中心区的EGFPnegNG2+细胞增殖在损伤后7 d达高峰.损伤后EGFP+NG2+细胞的Olig2、Sox10、Sox17等转录因子、基本的膜电生理参数以及钾电流表型均与发育过程增殖的OPCs一致.EGFPnegNG2+细胞不表达少突胶质发生中的转录因子.EGFP+CC1+.少突胶质细胞6周时包含在EGFP+NG2+细胞增殖峰时表达BrdU的细胞.EGFPnegCC1+少突胶质细胞未被观察到.神经胶质生长因子2和成纤维细胞生长因子2处理促进少突胶质发生,提高EGFPnegNG2+细胞数量.因此,通过EGFP和转录因子表达,时空增殖类型及对生长因子的反应,两种类型的NG2+细胞对SCI刺激发生反应.SCI后EGFP+NG2+细胞经受细胞和生理变化特征,与在早期出生后的少突胶质发生过程中NG2+细胞中的变化类似.
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Olig2和Hb9在小鼠胚胎脊髓中的表达变化
目的 探讨少突胶质细胞系基因(oligodendrocyte lineage gene)Olig2和同源盒基因(Homeobox)Hb9在小鼠胚胎脊髓发育过程中的表达情况.方法选择小鼠的9.5～13.5 d胚胎脊髓,并分为E9.5 d组、E10.5组、E12.5 d组、E13.5 d组;采用免疫荧光方法检测Olig2和Hb9在胎鼠脊髓中的分布,同时用流式细胞仪检测分别标记Olig2和Hb9的阳性细胞百分率. 结果 免疫荧光染色显示在这5组胎鼠脊髓的腹侧都有Olig2和Hb9的表达,流式细胞仪检测显示E9.5 d组Olig2阳性细胞百分率高于其它4组,差异有统计学意义(P＜0.05),E11.5 d组Hb9的阳性细胞百分率高于其它4组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Olig2和Hb9可能与胎鼠脊髓运动前体细胞和运动神经元的发育有关.
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pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用
目的 构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用.方法 利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒.对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用.结果 通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中.结论 成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合.
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少突胶质细胞前体细胞在双环己酮草酰二腙诱导的脱髓鞘模型中的变化特点
目的 观察神经胶质细胞在双环己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)诱导的脱髓鞘模型中的变化特点,探讨其与髓鞘再生的内在联系.方法 选8周龄C57BL/6雄性小鼠,分为正常组、急性脱髓鞘组及髓鞘再生组.正常组每天饲养正常鼠粮；模型组小鼠饲养含有0.2％ CPZ的混合鼠粮,连续饲养6周；髓鞘再生组在连续喂养6周CPZ鼠粮后,换用正常鼠粮2周.实验过程中通过卢卡斯快蓝染色及透射电镜技术判断脑组织胼胝体区髓鞘脱失及恢复程度,通过免疫组化及免疫荧光技术检测脑内NG2,Olig2和GFAP的表达来评估少突胶质细胞前体细胞及星形胶质细胞的变化特点.结果 与正常组相比,急性脱髓鞘组胼胝体髓鞘脱失明显,Olig2、GFAP表达明显升高(P＜0.05),侧脑室旁外侧隔核(LSD) NG2升高水平较胼胝体区(CC)更为明显(P＜0.05,P＜0.01)；髓鞘再生组髓鞘有所修复,Olig2、GFAP表达仍高于正常组,但较急性脱髓鞘组有一定程度降低(P＜0.05).结论 髓鞘损伤期少突胶质细胞前体细胞不能有效迁移至受损部位,修复期Olig2表达降低,星形胶质细胞持续高水平表达可能是髓鞘修复障碍的影响因素.
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实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠大脑Olig基因表达的变化规律
目的 研究实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)大鼠大脑Olig1,Olig2和Nkx2.2基因的表达规律.方法 采用注射豚鼠脊髓匀浆的方法制作Wistar大鼠EAE模型.实时RT-PCR检测基因表达的相对值.结果 正常大鼠大脑Olig1,Olig2和Nkx2.2都低水平表达.EAE大鼠症状发作后第6天,其表达水平达高峰,与正常组比较,相差显著(P＜0.05).三者的变化规律一致.结论 Olig基因表达量的增高程度可能是EAE大鼠髓鞘修复不完全的因素之一.
关键词： 实验性态反应性脑脊髓炎 Olig1 Olig2 Nkx2.2 -
过表达Olig2的少突胶质前体细胞在缺血缺氧脑白质损伤新生大鼠脑内的分化
目的:观察过表达特异性转录因子Olig2的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells, OPCs)移植在缺血缺氧(hypoxia-ischemia,HI)脑白质损伤新生大鼠脑内的分化情况.方法:用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的过表达Olig2的慢病毒感染原代分离纯化的大鼠大脑皮层OPCs,GFP阳性细胞计数测其感染率.将过表达Olig2的OPCs(Olig2组)或阴性对照病毒感染的OPCs(Vector组)脑立体定位注射到造模后7d的HI模型大鼠胼胝体膝部,移植后2周,冰冻切片行免疫荧光染色观察OPCs的存活和分化情况.结果:Olig2-GV218病毒感染OPCs细胞48 h,荧光显微镜检测显示85％左右的OPCs细胞表达GFP;移植后2周,caspase-3荧光染色表明移植后绝大部分细胞存活,Vector组和Olig2组之间无统计学差异(P＞0.05);GFAP/GFP双阳性细胞在两组之间也无显著差异(P＞0.05);而Olig2组MBP/GFP双阳性细胞的荧光密度显著高于Vector组(P＜0.05).结论:过表达Olig2可促进移植OPCs向少突胶质细胞分化.
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稳定过表达Olig2的小鼠胚胎干细胞系的建立
目的:建立稳定过表达Olig2的小鼠胚胎干细胞(mESCs)系.方法:从含有Olig2的质粒中利用PCR技术克隆O1ig2基因编码序列,酶切连接入GV218载体,形成Olig2-GV218重组载体.将构建好的Olig2-GV218载体与两种病毒辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,制备并浓缩慢病毒颗粒,侵染mESCs,嘌呤霉素筛选的阳性克隆传代培养10代后鉴定细胞内Olig2的表达.结果:PCR扩增得到含Olig2基因编码序列的特异性条带.重组的Olig2-GV218载体中Olig2编码序列与目标序列几乎一致.携带有Olig2-GV218载体的慢病毒能够正常感染mESCs,表达Olig2-GFP融合蛋白,并稳定遗传.结论:成功建立了稳定过表达Olig2的小鼠胚胎干细胞系.
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在神经干细胞中Sox2直接调节Olig2的转录活性
目的 研究Sox2对Olig2直接转录调节.方法 荧光素酶报告基因法(Luciferase assay)检测Sox2对 Olig2基因启动子激活作用;染色质免疫共沉淀法(CHIP assay)验证体外培养的神经干细胞中Sox2与Olig2基因启动子DNA的结合位点.结果 在神经干细胞中,Sox2转录因子与Olig2基因启动子DNA存在结合(-1232--977, ATG为+1),并能在体外激活Olig2的转录.结论 Sox2可直接调节Olig2基因的转录活性,参与干细胞向少突胶质分化潜能的维持.
