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改良差时贴壁法分离培养鉴定小鼠骨髓间充质干细胞和内皮前体细胞
目的 探索同时从小鼠骨髓分离培养间充质干细胞(MSCs)与内皮前体细胞(EPCs)及对其鉴定的方法.方法 小鼠骨髓细胞经改良差时贴壁法分离,以48h为时间点,48h内贴壁细胞传至3代后行成骨、成软骨、成脂分化诱导实验,流式细胞术(FCM)检测其表面标记;48h后收集未贴壁细胞,传至3代后行血管形成实验,传至5代后行CD31免疫荧光细胞染色实验,FCM检测其表面标记.结果 第3代48h内贴壁细胞可诱导分化为骨、软骨和脂肪细胞,FCM检测Sca-1、CD29、CD45、CD11b阳性率分别为(98.30 ±0.75)％,(97.47±1.32)％,(1.87±0.15)％,(1.03±0.71)％;第3代48h后贴壁细胞在基质胶上可形成血管样结构,第5代48h后贴壁细胞特异性表面抗原CD31呈阳性表达,FCM检测CD34、CD133、血管内皮生长因子受体(VEGFR2)阳性率分别为(88.90±1.18)％,(92.73 ±2.90)％,(87.63±1.79)％.结论 采用改良差时贴壁法可同时分离培养扩增小鼠骨髓MSCs和EPCs,且简便高效稳定可重复.
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自体内皮前体细胞移植促缺血心肌血管新生的实验研究
目的 研究从外周血中获取的内皮前体细胞自体移植后促进心肌缺血区域血管新生的可行性和有效性,欲为冠心病患者的治疗提供新的细胞移植学方法.方法 抽取动物的外周动脉血,应用密度梯度离心法获取单个核细胞.应用加入VEGF和bFGF的特定培养基培养后,获得CD31、CD34、Flk-1和vWF免疫荧光染色阳性的内皮前体细胞;结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;然后将得到的自体细胞重新植入缺血心肌局部区域.对照组注入细胞培养液.结果 移植组与对照组比较,HE染色显示心肌胶原纤维融合较少,组织排列结构更为有序;移植区域微血管密度明显增高.结论 通过一定的体外分离、定向分化、培养、扩增途径,可以从外周血获得较为纯化的内皮前体细胞;内皮前体细胞移植对局部梗死心肌组织结构有一定的保护作用,并可促进血管新生.
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体外诱导骨髓CD34+细胞生成血管内皮细胞的方法
目的体外分离狗骨髓CD34+细胞,建立诱导分化血管内皮细胞的方法,并进行生物学鉴定.方法利用免疫磁珠法分离狗骨髓CD34+细胞,在体外经血管内皮细胞生长因子(VEGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导后,观察细胞生长状况,以光镜、电镜进行形态学鉴定,应用免疫组化方法检测冯维靳布兰德因子(Von Willebrandfactor,vWF)表达.结果光镜下细胞单层融合生长,呈铺路石样形态,单个核位于中央,细胞群体倍增时间为35 h.电镜下可见到Weibel-Palade小体,在细胞胞浆vWF染色阳性.结论采用免疫磁珠法可从骨髓获得高纯度的CD34+细胞,在体外诱导分化成血管内皮细胞.
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脐血来源的人类内皮前体细胞培养的实验研究
目的:探讨在体外细胞培养、增殖人类来源的内皮前体细胞的技术方法.方法:从人脐血中获取单个核细胞,体外定向分化,并扩增内皮前体细胞.结果:4×107个脐血单核细胞经定向培养之后可以获得约106个内皮前体细胞.从脐血中分离并定向分化培养后,经流式细胞计数证实(78.05±1.16)%细胞呈内皮前体细胞表面抗体CD34和人类VE-Cadherin双阳性;有(79.69±1.53)%细胞摄取荧光低密度脂蛋白;免疫组化染色证实(80.60±2.52)%细胞Ⅷ因子染色阳性.结论:使用定向诱导的方法,可以从人类脐带血中获取较多的具有内皮细胞潜能的前体细胞.
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几种肾素-血管紧张素系统抑制剂对大鼠外周血内皮前体细胞作用的研究
目的:观察正常大鼠应用临床推荐剂量的血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体拈抗剂后,外周血内皮前体细胞(EPCs)克隆数量、分泌一氧化氮能力、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白水平.方法:48只雄性SD大鼠随机平均分为6组(每组8只),对照组给予生理盐水,余5组每日灌胃给药,血管紧张素转换酶抑制剂:培哚普利组给予培哚普利1.33 mg/(kg·d)、雷米普利组给予雷米普利1.67 mg/(kg·d)、福辛普利组给予福辛普利6.67 mg/(kg·d)、卡托普利组给予卡托普利25 mg(kg·d),血管紧张素受体拮抗剂:替米沙坦组给予替米沙坦13.33 mg/(kg·d),共2周.2周后取外周血体外培养EPCs.免疫荧光染色及实时聚合酶链反应鉴定细胞表面标志.计数细胞克隆,检测细胞培养液上清一氧化氮含量,免疫印迹杂交方法分析细胞eNOS及Caspaee-3表达.结果:各组细胞培养至10～14天形成"铺路石"样克隆,经鉴定符合晚期EPCs特点.各药物组与对照组相比,细胞克隆数均有增多趋势,但只有卡托普利组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);各药物组间差异无统计学意义.雷米普利组、福辛普利组及替米沙坦组与对照组相比,细胞培养上清液中一氧化氮含量亦有升高,差异有统计学意义(P
关键词： 血管紧张素转换酶抑制剂 血管紧张素受体拈抗剂 内皮前体细胞 -
人体外周血来源成体内皮前体细胞在体外培养过程中的单核细胞和巨噬细胞功能表现
目的:研究成体内皮前体细胞生物学特性,尤其对该种细胞所表现的单核细胞和巨噬细胞特点进行探讨.方法:人体外周血来源的单个核细胞被接种于纤维粘连蛋白(Fibronectin)包被的培养皿中,在EGM-2培养液中培养.描述贴壁细胞生长曲线,对细胞表型及功能特点进行检测.结果:部分单个核细胞变形成为长梭形细胞,但未表现出明显的增殖能力.这些细胞可以表达部分内皮系表面标志物及单核细胞标志物CD14.在第4,14,28天进行的Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)和印度墨汁双摄取实验显示这种细胞能够同时吞噬这两种物质,却没有类似于内皮细胞的体外成血管现象,从而说明这种细胞有类似于单核细胞和巨噬细胞的吞噬功能.结论:人体外周血单个核细胞来源成年内皮前体细胞在体外培养过程中表现典型的单核巨噬细胞功能,且无明显增殖能力.
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Slit-Robo信号通路与血管系统发展的研究进展
血管系统的发展包括血管发生和血管生成.血管发生是指内皮前体细胞即成血管细胞分化为内皮细胞.而血管生成是已存在血管长出新毛细血管的过程,包括细胞出芽和新毛细血管的重构.胚胎时期机体通过血管发生和血管生成形成新血管,成年后机体主要是生理性的血管生成(伤口愈合,胚胎发育等)和病理性的血管生成(心脑血管疾病,肿瘤的生长与迁移,类风湿关节炎等).血管生成过程中起主要作用的是血管内皮细胞,它存在于所有血管,通过内皮细胞的迁移、增殖、分化和结构重建构成了新的毛细血管网.
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不同药物对内皮前体细胞的动员
目的研究不同剂量的阿托伐他汀及雌激素、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)在不同时相对内皮前体细胞(EPCs)的动员作用,以寻求合适药物、用药剂量及佳作用时间.方法将48只体重为2～2.5 kg的雄性新西兰兔随机分为六组:每组8只,即对照组,阿托伐他汀2.5 mg组、5 mg组、10 mg组,雌激素组,G-CSF组.用药后1、2、3、4周测量外周血EPC含量.启用流式细胞仪计数PE-CD34/FITC-CD133双阳性细胞为EPC;荧光显微镜鉴定FITC-UEA-1/Dil-acLDL双染色阳性细胞为EPC.用药第3周测血清一氧化氮(NO)、血脂.结果用药1、2、3、4周六组外周血EPCs的曲线:对照组为一低水平基线;G-CSF组持续稳定于高水平;阿托伐他汀5 mg组、雌激素组、阿托伐他汀2.5 mg组(按作用从大到小排列)为锯齿样曲线,第2周低,第3周高,第4周较第3周低;阿托伐他汀10 mg组与对照组接近,仅第4周增高(P<0.05).从用药1周开始到第4周,阿托伐他汀5 mg组与G-CSF组对EPCs有持续动员作用,第3周该两组效果佳,约为第1周的3倍,是对照组的近20倍;阿托伐他汀2.5 mg组在第3、4周有作用,P<0.05 ,P<0.01;雌激素组EPCs在第3、4周有作用,第3周尤明显,此时雌激素与G-CSF组作用相当,但不及阿托伐他汀5 mg组明显,P<0.01.第4周,五个用药组EPCs均较对照组高,其中G-CSF组高,另外四组次之,且这四组间无统计学差异.第3周检测血清NO,与对照组相比,阿托伐他汀5 mg组和雌激素组NO 增高,阿托伐他汀10 mg组降低,P<0.01.各组血脂均在正常范围内.结论阿托伐他汀、雌激素、G-CSF对EPCs均有动员作用,且不同药物组对EPCs的动员效果与时间有交互作用.动员效果为:G-CSF组>阿托伐他汀5 mg组>雌激素组>阿托伐他汀2.5 mg组>阿托伐他汀10 mg组.阿托伐他汀5 mg组在第3周效果佳.G-CSF对EPCs动员稳定于高水平.阿托伐他汀和雌激素对EPCs的动员可能与NO有关.
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治疗性血管新生研究进展(文献综述)
基于内皮前体细胞(EPC)移植的治疗性血管新生,成为血管内皮功能紊乱和缺血性疾病的新的治疗措施,从20世纪70年代Folkman提出血管生成的概念,经过内皮细胞生长因子基因导人的治疗性血管新生到内皮前体细胞移植治疗性血管新生,对血管新生的认识发生了明显的变化.本文回顾了EPC移植的基础研究和临床试验研究,并对治疗性血管新生的临床应用前景进行了展望.源于骨髓/外周血/脐带血的EPC移植有可能成为缺血性疾病治疗的手段.
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人外周血内皮前体细胞体外增殖规律的动态观察及其特性
目的:探讨人外周血内皮前体细胞(endothelial progenitor cells EPCs)体外诱导分化为内皮细胞(ECs)的生长增殖规律及其特性,以期证实人外周血是临床治疗缺血性疾病一个理想的内皮前体细胞来源.方法 密度梯度离心提取单个核细胞,接种在人纤连蛋白包被的培养板上,培养于含有促血管生长因子VEGF、b-FGF、IGF、EGF等的内皮生长基质EGM-2 MV中.每天倒置显微镜观察,并记录.4d后去除未附着细胞,继续培养黏附细胞,同时,黏附细胞用Dil-AC-LDL和FITC-UEA-1进行免疫荧光染色,荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察.收集第7d的黏附细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志CD34和CD31.结果 接种1d后,一些细胞变形;2d后,有细胞团形成;3d后,细胞团周围一些贴壁细胞开始出现;4d后,黏附细胞呈短梭形或多角形贴壁生长,荧光显微镜、共聚焦激光扫描显微镜下可观察到Dil-AC-LDL和FITC-UEA-1双阳性的黏附细胞;第6d、7d,黏附细胞呈长梭形;FACS分析,CD34和CD31阳性率分别为(14.13±2.79)%、(54.67±3.44)%.结论 外周血中确实存在EPCs,并且在促血管生长因子VEGF、b-FGF、IGF、EGF等的刺激下能分化为成熟的内皮细胞.EPCs可望作为临床血管再生的细胞治疗
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雌激素对外周血内皮前体细胞影响的实验研究
目的 研究雌激素对内皮前体细胞(EPC)的动员作用,并探讨其血管保护作用机制.方法 将♂新西兰兔分为2组:对照组和雌激素组;用药后1,2,3,4周,测量外周血的EPC含量;第3周,测血清一氧化氮(NO)和血脂水平.结果 用药1,2,3,4周,EPC曲线:正常组为低水平基线.雌激素组为锯齿状曲线;第3周高,且该组第3,4周均有作用,(P＜0.01).NO水平雌激素组较正常组增高(P＜0.05);2组血脂均在正常范围内.结论 雌激素对EPCs有动员作用,这可能与NO有关.
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内皮前体细胞在动脉粥样硬化发生中的作用
内皮前体细胞(endothelial progenitor cell,EPC)能够分化成内皮细胞,在损伤内皮的修复和血管新生中发挥重要作用.内皮功能障碍启动白细胞黏附、脂质过氧化等导致动脉粥样硬化(atherosclerosis)的一系列过程,内皮损伤和修复失衡引发动脉粥样硬化的理论被广泛接受.EPC的数量和功能能够预测心血管疾病的发生和预后,多种动脉粥样硬化的危险因素降低EPC水平,动物实验中给予EPC细胞治疗能够减轻动脉粥样硬化的严重程度,以EPC为基础的细胞治疗可能成为治疗动脉粥样硬化新的希望.
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肿瘤血管与肿瘤干细胞
实体肿瘤的生长浸润依赖于肿瘤内新生血管的形成,肿瘤内血管系统的建立可以通过多种方式进行.以前的研究认为,构成肿瘤血管的内皮细胞可能源自宿主骨髓的内皮前体细胞、成血管细胞或已形成的血管壁内皮细胞.马赛克血管和拟血管生成丰富了肿瘤新生血管理论,但其理论认为血管可以在内皮缺如的情况下形成.这样就对传统的肿瘤血管内皮细胞的来源提出了挑战.本文通过对相关文献的研究,拟应用肿瘤干细胞理论来解释肿瘤血管的生成.
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内皮前体细胞研究进展及其应用
内皮前体细胞(EPC)是一类能分化成为血管内皮细胞(EC)的干细胞,包括成血-血管干细胞和内皮干/祖细胞.由于内皮前体细胞在人体内骨髓、外周血、脐血中均可获得,自体来源无免疫排斥,参与出生后血管发生,能在体外扩增并进行基因修饰等特点,在组织工程、血管新生与疾病治疗中有广泛的用途,现就其来源、表面标志、出生后体内分布与获得、生理病理意义和临床应用研究作一综述.
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内皮前体细胞与心血管疾病
细胞治疗能用于治疗因炎症、损伤、年龄增长所致劳损及细胞凋亡引起的心血管疾吗?这可能又是医学界的一个里程碑.近年来干细胞领域研究取得了巨大进步,成人多能干细胞可以生成多种组织,包括内皮和肌肉.近表明骨髓来源的内皮前体细胞可分化为心肌,并改善心功能.这些事实为临床研发新药、治疗缺血性疾病提供了新的策略,也使临床上部分经药物治疗不能控制症状且无冠脉支架或搭桥指征的病人有了救治的希望.
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内皮前体细胞在类风湿关节炎发病机制中的研究进展
自发现内皮前体细胞(endothelial progenitor cell,EPC)参与成人血管发生后,EPC因其在缺血性血管损伤的修复和恶性肿瘤的血管增殖中的作用而日益受到重视.
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内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管:适比例验证
目的:由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件.实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长,以及两种细胞的适比例.方法:实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①实验材料:新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院,产妇知情同意.②实验方法及评估:从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞,免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况;采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞,经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型;无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶,在其上以3:1～4:1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞,并观察两种细胞联合培养时的形态,分析两种细胞合适的种植比例;免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况.结果:①原代培养的平滑肌细胞呈典型"波峰谷"形态,荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性.②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后,呈现出"铺路石"样形态,表达CD31、vWF,结合荆豆凝集素,提示具备成熟内皮细胞特性.③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛,与平滑肌细胞以3:1～4:1的比例种植在I型胶原凝胶培养一段时间后,内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持,形成血管样网络结构.④共培养1周后,CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接,形成环形结构.结论:内皮前体细胞和平滑肌细胞以3:1～4:1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成.
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生物可降解高分子材料载内皮前体细胞CD34抗体涂层支架防治犬冠脉再狭窄的研究
目的 评估携带内皮前体细胞CD34抗体冠脉内支架对冠状动脉支架置入术后血管内膜增生的影响.方法 以多聚物为载体应用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫)-丙酸酯(SPDP)方法制成内皮前体细胞CD34抗体洗脱支架.以球囊扩张法建立犬冠状动脉狭窄模型,随机分为三组,每组5只,将紫杉醇支架、CD34抗体支架、裸支架分别植入到每组犬的冠状动脉狭窄段,4周后处死取出支架段血管行病理学观察及计算机图像分析血管总面积(TA)、内膜增生面积(IA)以及内膜增生面积百分比.结果 CD34抗体支架组内膜增生面积及内膜增生百分比较裸支架组减低(P＜0.05),紫杉醇支架组内膜增生面积及内膜增生百分比较裸支架组也减低(P＜0.05),但较CD34抗体支架组无明显差别(P＞0.05).结论 生物可降解担载内皮前体细胞CD34抗体支架较裸支架,可明显加速内皮修复,明显降低再狭窄的发生,是一极具前景的研究方向.
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大鼠脑局灶缺血/再灌注对循环CD34+造血干/祖细胞和血管内皮生长因子的影响
近年来学者们发现人和动物的循环血液中存在一群来自骨髓的造血干/祖细胞,CD34抗体标记阳性.它们在一定的条件下能分化成内皮细胞,参与新血管形成.所以学者们又将这一部分细胞称为内皮前体细胞(Endothelial Progenitor Cells EPCs).在体内缺血或体外细胞因子的刺激下,循环的内皮前体细胞(EPCs)能够定向迁移到缺血或损伤部位,参与局部的血管形成.研究发现在成年小鼠的缺血大脑组织中也有来自骨髓的EPCs参与脑的血管生成.由此推测大脑缺血也会动员骨髓干细胞,使循环中的EPCs增多,参与脑的血管生成.故本实验即观察大鼠 MCAO脑缺血/再灌注模型中循环CD34+造血干/祖细胞数量的动态变化,同时观察血浆中血管内皮生长因子(VEGF)含量的动态变化,并探讨两者的关系.
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内皮前体细胞在脑缺血中作用的研究进展
急性脑缺血发生后,及时有效的血管再通、血流重建对于脑细胞的保护作用至关重要.目前,主要有脉管内注入纤维蛋白溶解物、血管内介入治疗、外科治疗等,具体术式主要包括经皮腔血管成形术和支架植入术(PTAS)和血栓切除术[1].尽管溶栓和介入治疗已经取得一定的疗效,但静脉内应用重组人组织纤溶酶原激活剂(rt—PA),时间窗非常窄(3～4.5 h)[2],PTAS在发病后第1年具有高风险脑缺血复发率(20％)[1].
