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不对称PCR制备单链探针检测登革Ⅱ型病毒复制型RNA和复制中间体RNA
登革病毒是具包膜的单股正链RNA虫媒病毒,病毒的复制过程发生在感染细胞胞浆,复制型(RF)RNA是病毒半保留复制的循环模板,复制中间体(RI)RNA的合成则是病毒复制所必需的.经RT-PCR获得的DNA模板进行不对称PCR扩增,当限制性引物终浓度为250nmol/L,两引物比例为100∶1时,即得到不对称PCR的预计单链和双链DNA产物.此单链产物用于标记探针进行核酸杂交.结果表明不对称PCR制备单链探针进行核酸杂交可用于检测病毒复制型RNA和复制中间体RNA的合成.
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应用不对称PCR提高PRRSV-CSFV-JEV共检芯片的杂交效率
目的 比较采用普通RT-PCR和不对称PCR分别进行样品的直接荧光标记,应用于cDNA芯片杂交,分析其对芯片杂交效率的影响.方法 以本实验室建立保存的重组质粒和病毒为模板,进行不对称RT-PCR引物浓度优化,应用普通RT-PCR与不对称RT-PCR进行直接荧光标记,将标记的产物与制备的cDNA芯片杂交,在相同条件下完成杂交后芯片的洗涤与扫描,记录扫描图片与数据.结果 与普通RT-PCR标记方法相比,应用不对称RT-PCR技术标记单链靶基因,能特异有效提高芯片的杂交效率.结论 应用不对称RT-PCR技术对样品进行荧光标记后,与cDNA芯片杂交能提高芯片的杂交效率,有利于cDNA芯片的检测应用.
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样品制备与扩增条件对寡核苷酸芯片杂交结果的影响
目的以HLA-A小阵列检测芯片为平台,确定HLA-A寡核苷酸芯片检测中优化实验条件.方法观察了样品制备方法(传统酚-氯仿法、白细胞裂解液法、Fe2O3纳米磁珠)、不对称PCR制备ssDNA的参数、PCR产物纯化方法对杂交结果的影响.结果3种不同的基因组提取方法均获得良好的特异性PCR扩增结果,纳米磁珠应用于样品提取和PCR扩增获得成功,实验条件需进一步完善;在不对称PCR佳实验条件为反向引物与正向引物浓度比25:1,正向引物浓度为0.04 μmol/L,PCR灵敏度可达ng(纳克)模板DNA,Qiagen纯化试剂盒效果略强于其它两种,但差异无显著性.结论本研究初步探讨HLA-A生物芯片样品制备条件,并取得理想结果,为寡核苷酸生物芯片的实际操作提供一定的参考和指导.
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新型多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒
目的 建立一种基于多重不对称PCR-电化学芯片技术同时检测多种甲型流感病毒的新方法.方法 根据常见型甲型流感病毒的基质蛋白(matrix protein,MP)、血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase transferase,NA)基因的保守序列分别设计特异性引物和探针,建立优化多重PCR反应体系,再结合电化学芯片技术建立多重不对称PCR-电化学芯片法检测甲型流感病毒,对所建方法进行特异性和敏感性评价,同时检测200例流感样动物咽拭子样本. 结果 本方法检测灵敏度可达1×103 copie s/mL,200例动物样本中检出194例阳性,敏感率为97％. 结论 本研究建立的多重不对称PCR-电化学芯片法可同时检测常见类型甲型流感病毒,具有较高的特异性和灵敏度,且操作较简单、检测周期短,便于临床筛查、诊断和治疗.
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HBV多药耐药变异检测试剂的研制和初步评价
目的 研制一种基于反向点杂交技术检测HBV多药耐药变异的核酸检测试剂并对其临床应用进行初步评价.方法 针对HBV P开放阅读框逆转录酶编码区的相对保守序列,设计引物探针,并设计内标和对照探针,制备HBV检测膜条,构建克隆,后采用已构建好的克隆和50例临床样本进行检测并与测序做比较.结果 克隆和50例临床样本均成功检出,反向点杂交检测结果与DNA测序结果符合率分别为100%和98%.结论 本试剂具有低成本、准确度好等优点,在HBV感染辅助诊断和合理用药方面具有较好的应用前景.
关键词： 乙型肝炎病毒(HBV) 多药耐药 突变 反向斑点杂交 不对称PCR -
大容量人源单链抗体库构建中轻链重链可变区的连接
目的单链抗体库的构建过程中,多采用轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、和linker 3条片段重叠延伸拼接法(SOE)进行连接.为了优化抗体库的多样性,提高效率,探讨了新的连接方法.方法通过不对称PCR制备单链DNA,再俩俩连接,得到单链抗体(ScFv)基因.分别将SOE法及不对称PCR法连接得到的ScFv基因与载体连接,转化E.coli TG1,构建抗体库.结果后者只需25次连接反应,78次电击转化,既可达到1×1010库容量.结论可以认为新方法具有更高的基因构建效率,并有效提高了抗体库的多样性.
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不对称PCR杂交显色方法的建立及其对HBV DNA的检测
目的:建立一种灵敏、快速、特异的检测HBVDNAPCR产物的杂交显色方法.方法:使用一个生物素标记的上游引物对HBVDNA进行不对称PCR扩增,使扩增出的单链带有生物素,并可结合在固定有链亲合素的微孔板表面.用标有辣根过氧化物酶的探针与固定的单链PCR产物杂交,而后加底物显色测定吸光值.结果:该方法比常规的琼脂糖凝胶电泳法更特异,而且灵敏度高10倍～100倍,对简便处理的标本适应性强,具有良好的重复性.结论:该方法可以代替琼脂糖凝胶电泳法,有望成为PCR产物定性检测的常规临床检验方法.
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高效阴离子交换色谱法分离不对称PCR产物
目的为分离制备高纯度的DNA单双链提供新的技术方法.方法利用SOURCE15Q强阴离子交换柱分离纯化DNA单双链,并测定回收率.结果SOURCE 15Q柱在紫外检测波长为260nm,流速为1ml/min,流动相为pH9.0时,以20mmol/L Tris-HCl缓冲液+2.0mol/LNaCl,线性浓度梯度洗脱的分离条件下,能很好地对85个碱基长度不对称PCR产物的单双链进行分离;对24mer单链样品进行回收率测试,回收率为92.46%.结论利用SOURCE 15Q强阴离子交换柱分离纯化DNA单双链的方法简便、快捷、稳定、分辨率高、纯度高,适合核酸单链和双链样品的分离、纯化、鉴定和制备.
