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新生儿免疫球蛋白重链可变区基因多样性分析
目的构建不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱,探讨新生儿成熟度对IgH基因谱型多样性的影响.方法提取27～42周新生儿RNA、进行RT-PCR反应、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色,获得不同胎龄新生儿IgH基因指纹图谱,用Tiger凝胶图像分析仪进行曲线转化和分析.结果各家族指纹图谱转化后的曲线下面积积分值,在28～32周、33～36周和37～42周新生儿之间无差异;但胎龄27周新生儿曲线下面积小于胎龄28～42周新生儿.结论 28周可能是人类IgH基因谱型发育由不完善到趋于完善的一个转折点,28周到足月的新生儿IgH基因谱型发育趋于稳定.
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同源比较法克隆单抗CAb-1重链可变区基因
目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因.方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR1 5'端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体基因VH的准确序列.结果选定了与已知抗体VH高度同源的序列进行引物设计.凝胶电泳可见预期大小DNA条带.经测序表明,配对于信号肽处的扩增产物不仅与配对于抗体可变区FR1的结果一致,而且也纠正了配对于CAb-1的VH的FR1的兼并引物所引入的氨基酸突变.结论所优化设计的引物能够扩增完整的抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因,为小分子工程抗体改造奠定了基础.
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羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定
本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础.用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期.结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35 h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础.
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胶质瘤单链抗体的基因构建及表达
单链抗体(ScFv)因其能较好地保持对抗原亲和活性,分子量小,穿透力强,抗原性弱,且易与效应分子相拼接,是构建免疫毒素和双功能抗体的较理想元件.我们在已克隆抗胶质瘤单抗SZ39重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的基础上,构建了抗人脑胶质瘤ScFv基因,并克隆于表达载体pGEX-5X-1,在大肠杆菌中诱导表达,现将结果报道如下.
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抗核抗体独特型多肽对慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠的作用及其机制探讨
狼疮肾炎(LN)是育龄妇女的好发病之一,LN的治疗仍是临床的一大难题.目前国际上已有人尝试用主动免疫治疗LN[1].抗核抗体独特型多肽具有SNF1小鼠抗一dsDNA抗体的独特型,其结构与此抗体重链可变区的一组多肽片段相似[2].为探讨独特型多肽这种保护作用的机制,我们在以往实验的基础上进一步观察了慢性移植物抗宿主病狼疮样肾炎小鼠体重、尿蛋白定量、肾脏组织学变化和血清IL-6水平的变化[3].
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新生儿免疫球蛋白重链可变区基因重排研究
目的 探讨不同胎龄新生儿免疫球蛋白(Ig)重链可变区(VH)基因重排情况.方法 排除宫内感染的新生儿,其中胎龄27周4例,28～32周9例、33～36周12例、37～42周13例,提取其外周血RNA、进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增其IgVH基因、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色.结果 各个胎龄VH1～VH7各家族均有多个重排条带表达,同一个VH家族重排基因的平均中分子量在各个胎龄组间差异无显著性.结论 27～42周新生儿IgVH基因VH1～VH7家族重排均具有多样性;对同一个VH家族来说,28～42周各胎龄组IgVH基因重排无显著性差异.
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单链抗体表达研究进展
单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成.在目标特定的scFv上连接放射性核素、生物毒素、药物,将极大增强对靶细胞的杀伤能力.Kanter等[1]研究发现将个体基因型scFv和细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或免疫刺激肽组成融合蛋白,是一种有效治疗淋巴瘤的疫苗.Wang等[2]通过抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和抗单端孢霉毒素(ZEN)scFv基因融合.表达为抗DON和抗ZEN scFv,结果显示双功能抗体成功构建.并可应用于DON和ZEN检测.
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人源性单链抗体在生殖器疱疹治疗中的应用
单链抗体(scFv)是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因通过一短肽链连接后融合表达出来的抗体片段,其大小为完整抗体分子的1/6,有与天然抗体相同的抗原结合特征,它又缺乏Fc片段,失去了Fc介导的受体结合作用,使得其快速向靶部位集中;同时scFv还具有分子量小,易入靶细胞,有较强的组织穿透力;免疫原性低,不易产生人抗鼠抗体反应;无Fc段,不易与靶细胞外的细胞结合,且组织分布率高等特点.
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特异性抗肝癌噬菌体单链抗体库的构建及鉴定
噬菌体单链抗体（ScFv）弥补了传统McAb制备繁琐、抗原性强、穿透力弱等不足，为HCC临床和基础研究提供新的手段。我们用基因工程技术和噬菌体表面呈现技术构建和筛选特异性抗HCC噬菌体ScFv库。 1. 材料与方法：(1)抗HCC噬菌体ScFv库的构建：应用HCC细胞常规免疫BALB/C小鼠，从其脾脏提取tRNA并纯化mRNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增抗体轻链和重链可变区，应用linker-（Gly4Ser）3装配ScFv基因，在其5′端和3′端分别引入内切酶SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，连接到噬菌体载体pCANTAB 5E，转化大肠杆菌TG1细胞，铺SOBAG平板，记数菌落。
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用聚合酶链反应制备抗端粒酶蛋白重链和轻链可变区基因
目的:为了制备抗端粒酶蛋白hTERT可变区基因.方法:采用Ni-NTA树脂层析法从PBKTRT转染的E.coliJM109阳性菌中分离纯化端粒酶蛋白hTERT,并免疫小鼠.从免疫的小鼠脾脏中提取淋巴细胞中总RNA,逆转录成cDNA,以逆转录合成的cDNA第一条链为模板,分别用VH和VL引物,通过PCR进行扩增.结果:PCR扩增反应产生350bo大小的抗hTERT重链和轻链可变区基因.VH和VL基因片段的获得为进一步制备抗hTERT单功能区抗体(dABs)和单链抗体ScFv奠定了实验基础.结论:提示该方法具有稳定性好,易于重复,扩增后VH和VL量较高的优点.
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输注利妥昔单抗时不良反应的预防和护理
利妥昔单抗(美罗华)是一个主要针对B细胞表面CD20分子的嵌合型单克隆抗体.由鼠抗CD20单抗的2B8轻链和重链可变区及人的轻链和重链恒定区组成的人源化的嵌合抗体,能以极高的亲和力与B淋巴细胞上的CD20结合,通过抗体依赖的细胞介导细胞毒作用及补体介导的细胞毒作用,终导致细胞凋亡[1].由于95%以上的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞都有CD20抗原的表达,因此利妥昔单抗于1997年被美国FDA批准用于B细胞NHL的治疗,且近年来的实践证明它是CD20阳性NHL有前途的治疗药物,自其上市以来,全世界已有超过54万患者从利妥昔单抗的治疗中获益.同时,由于利妥昔单抗对外周血B细胞确切的清除效应和较少的毒性作用,近年也已被广泛应用于除B细胞淋巴瘤以外的其他B细胞疾病的治疗.但在输注过程中极易发生不良反应,我们在用药前后采取了一系列的措施,较好地避免了不良反应的发生,现报道如下.
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抗端粒酶蛋白hTERT重链可变区基因的克隆和表达
利用噬菌体表面展示技术制备端粒酶蛋白hTERT抗体.从重组的hTERT免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,逆转录成cDNA;以逆转录合成的cDNA第一条链为模板,用VHback和VHfor引物,通过PCR扩增出约350 bp 大小的抗hTERT重链可变区基因,将其克隆到噬菌粒载体PCANTAB 5E中,转化入E.coli TG1宿主菌后,在M13K07辅助噬菌体帮助下,将VH与g3蛋白形成的复合物展示于噬菌体表面.我们利用Dot Blot检测方法筛选出hTERT具有亲和性的VH单功能区抗体.结果提示噬菌体展示技术是制备抗体的一种有效的新途径.抗hTERT VH基因克隆成功,为进一步构建单链抗体ScFv奠定了基础.
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单链抗体在肿瘤治疗中的应用研究
1988年以来,抗体基因工程的研究取得了一些技术上的进展.Huston等[1]和Bird等[2]利用基因工程技术成功制备了单链抗体(single chain Fv ScFv或single chain antigen bindingprotein SCA),scFv是由免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的重组蛋白,它是具有完全抗原结合位点的小抗体片段,大小为完整抗体的六分之一,分子量约为27KD.它具有许多优点:①分子小,免疫原性低,用于人体不易产生抗异种蛋白反应;②容易进入实体瘤周围的微循环;③血循环和全身廓清快,半衰期短,肾脏蓄积很小;④无Fc段,不易与具有Fc受体的非靶细胞结合,成像清晰;⑤易于基因操作和基因工程大量生产.此外单链抗体还可以与毒素、前体药物转化酶、放射性同位素、细胞因子等效应分子构建成多种双功能抗体分子,单链抗体也是构建双特异抗体的理想元件,用于肿瘤的临床诊断和治疗显示出了具大的潜力.
