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新型肺结核三抗原组分疫苗的开发和小鼠免疫原性研究
目的 构建高效表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB) ESAT6、rv3407、RpfB三个显性抗原基因(3 antigens,3Ag) 的重组人5型腺病毒(Adenovirus 5,Ad5) 载体疫苗,在小鼠模型中初步完成药效学研究.方法 用AdEasyTM XL腺病毒载体系统构建重组质粒pAd5-3Ag,经Pac I线性化后转染AD293细胞获得表达3Ag融合蛋白的Ad5-TPA-3Ag; 采用Western blot检测腺病毒载体中融合蛋白的表达; 将纯化的病毒颗粒以肌肉注射和滴鼻两种方式免疫小鼠,采用ELISA检测血清中抗体效价,对病毒的免疫剂量进行优化.结果 含3Ag基因的重组腺病毒载体构建成功.包装的病毒Ad5-TPA-3Ag以8 × 107 IFU的剂量免疫小鼠42d时各抗原的效价高,ESAT6肌肉注射和滴鼻的高效价分别为4. 54和4. 87; rv3407肌肉注射和滴鼻的高效价分别为3. 41和3. 60; RpfB肌肉注射和滴鼻的高效价为3. 63和2. 42.结论Ad5-TPA-3Ag在小鼠模型中可以诱导良好的免疫应答,可能成为一种新型的针对MTB潜伏感染的候选疫苗.
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重组耻垢分枝杆菌Msmc2-CFP10-ESAT6的构建
目的 构建能表达结核分枝杆菌早期分泌蛋白CFP10-ESAT6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌.方法 采用基因拼接(Gene SOEing)法体外扩增结核杆菌1hp-ESAT6融合基因,插入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pBCG3000,构建重组穿梭表达质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,电转化耻垢分枝杆菌mc2155,构建耻垢疫苗株Msmc2155-CFP10-ESAT6,热诱导表达CFP10-ESAT6融合蛋白,Western blot分析其免疫原性.结果 经PCR、酶切及测序鉴定,证实成功构建重组质粒pBCG3000-CFP10-ESAT6,并在耻垢分枝杆菌中经热诱导表达出分子质量单位约为22 ku的CFP10-ESAT6蛋白,该蛋白可被结核病患者血清、鼠抗ESAT6血清和鼠抗CFP10血清识别.结论 结核分枝杆菌lhp-ESAT6融合基因在耻垢分枝杆菌中成功表达.
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结核分枝杆菌ESAT6基因的研究进展
结核分枝杆菌分泌许多蛋白到细胞外,对结核病的发生起着举足轻重的作用,其中6 ku早期分泌抗原靶分子(简称ESAT6)具有主要活性,可以显著活化巨噬细胞,提高巨噬细胞对胞内结核杆菌的生长抑制作用和杀伤能力,同时在保护性细胞免疫中发挥着作用,并介导长期持久的免疫记忆,ESAT6有望成为检测MTB抗体和研究新型疫苗的特异性抗原.本文就ESAT6的特点以及在诊断、疫苗方面得研究进展进行了综述.
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结核分枝杆菌特异性抗原 ESAT6的串联表达及其免疫原性研究
目的：表达并纯化ESAT6c2融合蛋白，并对融合蛋白免疫原性进行鉴定，以用作结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒的特异性抗原。方法全基因合成ESAT6目的基因，利用BamHⅠ和BglⅡ同尾酶串联目的基因，构建ESAT6c2-pET25b重组质粒，转化E.coli，诱导表达。Ni柱亲和纯化融合蛋白，测定浓度后应用到T.SPOT-TB试剂盒（Oxford）检测临床样本进行免疫原性研究。结果成功构建了ESAT6串联表达重组质粒，制备出高纯度的ESAT6c2融合蛋白。临床样本检测结果表明ESAT6c2融合蛋白作为刺激源，与临床诊断相比特异性为100%（20/20），灵敏度为84.61%（33/39）；与T.SPOT-TB试剂盒TA检测孔有较强一致性（Kappa＝0.932）。稳定性研究也表明，ESAT6c2融合蛋白经加速破坏试验后，与临床诊断相比特异性为100%（20/20），灵敏度为84.38%（27/32）；依然与T A检测孔有较强一致性（Kappa＝0.923）。结论获得的高纯度ESAT6c2融合蛋白，可以应用于结核菌特异性IFN-γElispot试剂盒。
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结核分枝杆菌CFP10和ESAT6优势肽段融合蛋白的表达及其免疫学研究
目的:构建结核分枝杆菌分泌蛋白的重组质粒及工程菌,获得纯化的CFP10-ESAT6P蛋白抗原,制备初步用于检测结核病患者的特异性抗体.方法:根据编码结核分枝杆菌基因序列设计引物,克隆表达结核CFP10-ESAT6重组蛋白,表达产物免疫新西兰大白兔,其中80%可产生高价的抗体.利用产物建立IgG间接ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果:应用ELISA法,通过检测113例结核病患者、82例非结核病患者及健康献血员,CFP10-ESAT6P和对照PPD对结核病患者血清检测的敏感性分别为89.4%和79.6%,特异性分别为96.3%和93.9%.结论:高效表达纯化的CFP10-ESAT6蛋白抗原性强,可用于结核病患者抗体的检测,用于结核病的辅助诊断.
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小鼠对结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫反应
目的 研究结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的免疫原性.方法 将40只BALB/c小鼠随机分成4组,NS组、BCG组、pcDNA-HspX组和pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX组,每组10只.BCG组只在0周时皮内注射卡介苗1次.NS组、pcDNA-HspX组及融合基因组分别于0、2、4周肌肉注射生理盐水和重组质粒DNA,共免疫3次.在免疫的第2周,4周及后一次免疫后2周检测体血清中的总IgG水平.同时,后一次免疫后2周,取脾细胞检测细胞免疫反应.结果 构建的融合基因重组质粒DNA免疫动物后能产生针对结核杆菌特定抗原的特异性细胞免疫和体液免疫应答,具有较强的免疫原性.结论 结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因可作为DNA疫苗进行保护作用的研究.
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结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建
目的 构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达.方法 用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19一T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-).重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达.结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白.结论 成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达.
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结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光表达载体的构建及表达
背景:Hsp65和Esat6之间的Linker编码一段疏水性多肽,其具有良好的柔顺性和折叠性,有利于翻译成融合蛋白时融合蛋白之间的空间折叠,使融合蛋白保持与两个天然蛋白空间构象的一致性,从而形成正确的构型而提高它们的免疫原性.目的:从结核分枝杆菌(MTB)H37Rv株中克隆目的融合基因Hsp65-Esat6,与报告基因EGFP一起构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.设计:单一样本实验.单位:暨南大学医学院微生物免疫学教研室.材料:质粒pVAE由华南理工大学曹以诚教授惠赠,MTBH37Rv株、大肠杆菌DH5α、表达质粒pEGFP-C1为本实验室保存,Hela细胞由本教研室胡萍博士惠赠.方法:实验于2005-09/2006-06在暨南大学医学院微生物与免疫教研室和中心实验室完成.以MTB全基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因(不含终止子),与pEGFP-C1载体进行重组,构建pEGHsp65(不含终止子)重组质粒.再以pVAE质粒为模板,经PCR扩增出Linker-Esat6基因,与pEGHsp65质粒(不含终止子)进行重组,构建真核表达载体pEGHsp65-Esat6.通过限制性内切酶图谱测定pEGHsp65-Esat6融合质粒大小;对质粒pEGFP-C1的多克隆位点内的DNA序列进行序列分析鉴定;将质粒转染Hela细胞,观察荧光的表达情况及转染效率,通过免疫组织化学法分别检测细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的表达.主要观察指标:①pEGHsp65-Esat6融合质粒大小.②pEGFP-C1DNA序列分析.③转染后Hela细胞的荧光表达情况.④细胞中Hsp65蛋白和ESAT-6蛋白的免疫组织化学结果.结果:①质粒pEGFP-C1的大小约为4.7 kb,而pEGHsp65为6.4 kb,融合质粒pEGHsp65-Esat6约为6.7 kb,在琼脂糖凝胶电泳图上可以分辨出泳动速度的差异.②结果与结核分支杆菌H37Rv株的Hsp65和Esat6的基因序列完全相同.③转染融合质粒24 h后,使用共聚焦显微镜可观察到有部分细胞表达荧光蛋白,说明融合质粒转染成功,转染率约为30%.未转染的Hela细胞则无荧光表达.④通过免疫组织化学法证实融合质粒在Hela细胞内能正确表达出具有生物学活性的Hsp65与ESAT-6蛋白.结论:采用Hsp65和Esat6搭配作为免疫原,成功克隆并构建了结核分枝杆菌融合基因Hsp65-Esat6荧光真核表达质粒.
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插入结核抗原基因的重组痘苗病毒对结核分枝杆菌感染恒河猴模型的免疫治疗分析
目的 分析插入结核抗原基因的重组痘苗病毒对结核分枝杆菌感染恒河猴模型的免疫治疗,开发用于结核病治疗用的新制剂.方法 将结核分枝杆菌H37Rv株直接接种至9只中国恒河猴的肺脏,建立猴感染模型,随机分为3组,其中2组经猴背部脊柱周围皮内分别注射重组MVA-Ag85a(A组)和MVA-Ag85a-ESAT6(AE组)进行治疗,另1组作为未免疫对照组.经过20周定期观察,计算生存率,检测病变组织病理评分和细菌载量;采集猴外周血,分离血清,进行抗原特异性IFNγ分泌水平检测及临床症状监测.结果 在实验终点,未免疫组仅存活1只猴,而A和AE组存活率为100％,与未免疫组相比具有明显的治疗作用.AE组组织病理总评分和细菌载量与未免疫组相比,显示较低的水平(P＞0.05),而A组未表现出同样的优势.抗原特异性IFNy分泌水平变化复杂,但差异无统计学意义(P＞0.05).食欲、咳嗽、体重等指征以及炎症反应蛋白、血沉的变化与抗结核免疫治疗之间无显著的相关性.结论 用重组MVA-Ag85a和MVA-Ag85a-ESAT6对结核分枝杆菌感染猴模型进行免疫治疗,取得一定的治疗效果,重组MVA-Ag85a和MVA-Ag85a-ESAT6或可作为结核感染的免疫治疗用候选分子.
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插入结核抗原基因的重组痘苗病毒对结核分枝杆菌感染恒河猴模型的免疫保护性
目的 重组亚牛痘病毒载体疫苗作为卡介苗的加强疫苗对结核病的免疫预防效果.方法 将18只雌性中国恒河猴随机分为3组:BCG、BCG+A和BCG+ AE组,每组6只,BCG+A和BCG+ AE组用4×105 CFU的BCG经皮内初免后9周,分别用重组亚牛痘病毒MVA-Ag85a(A)或MVA-Ag85a-ESAT6 (AE),按1×109 PFU/只的剂量通过皮内加强免疫,BCG组仅用BCG免疫,另设未免疫组(Non-V组):3只雄性中国恒河猴.加强免疫后9周,用结核分枝杆菌H37Rv株通过纤维支气管镜感染所有实验猴右肺下叶,攻毒剂量为41 CFU/只.经24周定期观察记录实验动物的临床表现,并采血进行血清学和免疫学检测.实验猴死亡或第24周处死后,全部尸检并进行病理学组织评分、组织细菌载量计数等检测.结果 在实验终点,Non-V组仅存活1只实验猴,而免疫组3组的存活率均为100％.体外免疫试验中,经重组痘苗病毒免疫的试验组表现出抗原特异性IFNγ明显升高(P＜0.05);组织病理总评分和细菌载量测定显示,BCG+A组优于BCG组,而BCG+ AE与BCG组比较,未表现出优势.结论 重组痘苗病毒MVA-Ag85a和MVA-Ag85a-ESAT6均能诱导抗原特异性IFNγ分泌,BCG+A组较BCG单次免疫组有更好的免疫保护趋势;BCG+ AE组未表现出较BCG组更好的免疫保护效果.
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结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和分泌蛋白Hsp16.3体外对人肝癌细胞HepG-2的作用
目的:探讨结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6及分泌蛋白Hsp16.3对人肝癌细胞HepG-2的作用.方法:将已构建的舍3种目的基因的表达载体pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6和pProEXHTb-Hsp16.3.分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6和Hsp16.3三种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性.复性的蛋白按照不同浓度和作用时间分别与肝癌细胞HepG-2反应,用MTT法检测细胞生长情况.结果:三种蛋白被成功纯化并复性.MTT数据统计分析显示,终浓度10ng/ml的三种蛋白对HepG-2细胞生长没有明显作用,当三种蛋白的终浓度分别为20、40、80μg/ml时均能够抑制HepG-2细胞的生长,并且抑制作用随着蛋白终浓度的增大以及作用时间的延长而增强.不同类别的蛋白抑制作用没有明显差别.结论:结核分枝杆菌的部分分泌蛋白能够抑制肝癌细胞HepG-2的生长.
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ESAT6抗原DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答
目的:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗,并观察其在BALB/c小鼠体内诱导的免疫应答.方法:构建结核杆菌ESAT6抗原DNA疫苗pVAX-ESAT6,并将其肌肉注射免疫BALB/c雌性小鼠,用ELISA方法检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG2a/IgG1)水平,并在体外用特异抗原刺激小鼠脾细胞,检测其分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4)的水平;用乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定小鼠细胞毒性T淋巴细胞反应.结果:pVAX-ESAT6 DNA疫苗诱导了抗原特异的体液免疫应答和细胞免疫应答,抗体亚型检测显示IgG2a与IgG1的比值为(2.28±0.4),脾细胞分泌的细胞因子水平检测显示IFN-γ的水平(360士45 Pg/ml)高于IL-4的水平(124±16 Pg/m).结论:成功地构建了pVAX-ESAT6 DNA疫苗,它能在小鼠中诱导抗原特异的免疫应答,应答类型以Th1型占优势.
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白的表达与纯化
目的 克隆表达结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425基因片段融合蛋白并纯化,测抗原的免疫原性,为结核病的临床诊断提供有效的候选抗原.方法利用生物信息学分析免疫优势位点,设计不同引物,采用聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增出相应基因片段,插入pET30a表达载体,转入大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,亲和纯化后用H37Rv免疫的兔血清进行间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定其免疫原性.结果PCR扩增的CFP10、ESAT6和Rv33425基因片段与基因文库(Genbank)报道的完全一致.三者在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达的产物约为22kDa,与预计大小相吻合.Ni-NTA亲和纯化出目的蛋白.ELISA显示该蛋白具有较强的免疫原性.结论结核分枝杆菌CFP10-ESAT6-Rv3425融合基因片段的融合表达纯化后,可作为结核病免疫诊断的一个候选抗原.
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结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表达、纯化及ELISPOT检测方法的建立与应用
以结核分枝杆菌CFP10、ESAT6蛋白原核表达、纯化体系为基础,建立稳定的ELISPOT方法;检测164份疑似结核患者标本的外周血ELISPOT,与临床诊断及T-SPOT·TB结果对比. 表达所得重组蛋白浓度和纯度如下:CFP10 为0. 5 mg/ml,84%;ESAT6为4 mg/ml,98%. ELISPOT方法佳实验条件为每孔细胞密度2 × 105/孔,CFP10、ESAT6蛋白抗原浓度分别为10 μg/孔,细胞孵育时间20 h. ELISPOT的灵敏度与特异度分别为88. 50%、82. 35%,检测结果与 T-SPOT·TB 方法结果一致(χ2 =0. 57).
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γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的临床应用
目的:探讨γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的使用效能及A(ESAT 6)、B(CFP-10)两种抗原的差异分析.方法:选取2015年6月~2016年2月住院并明确诊断的患者476例为研究对象,通过结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)检测患者外周血中结核致敏T细胞数量,分析该技术在结核病中的诊断效能,并比较A、B两种抗原的一致性.结果:T-SPOT.TB检测阳性率为47.1%(224/476例)、阴性率为52.9%(252/476)、灵敏度为78.1%、特异度为80.6%、阳性预测值为78.1%、阴性预测值为80.6%、阳性似然比为4.02、阴性似然比为0.27.T-SPOT.TB两种抗原A和B对不同患者的诊断无统计学差异(各组P值均>0.05);总诊断效能一致性较好(Kappa>0.75).结论:T-SPOT.TB检测对于结核病的诊断具有较高的灵敏度和特异度,且A、B两种抗原表现出不同的阳性检出规律和意义.T-SPOT.TB检测在结核分枝杆菌(MTB)感染的筛查、结核病快速早期辅助诊断和排除感染方面具有重要作用.
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结核分枝杆菌ESAT6疫苗的研究进展
结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的一种严重危害人类健康的重要传染性疾病.根据WHO发布的《2011年全球结核病(TB)控制报告》[1],患结核病的人数降到2010年的880万,结核病死亡数降到140万人,结核病死亡率在1990年和2010年之间下降了40％,除非洲之外,其他区域都可按期实现到2015年时使死亡率降低50％这一目标;但是流动人口剧增、结核菌与艾滋病毒双重感染和耐药结核菌病的增多均增加了结核病防治工作的难度,使得结核病疫情的形势依然严峻,防治任务仍然十分艰巨.在艾滋病感染患者中结核的发病率则更高,艾滋病毒携带者同时感染了结核分枝杆菌后,发生结核病的可能性是正常人的34倍.
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结核分枝杆菌ESAT6、CFP10基因DNA疫苗对小鼠免疫原性的初步研究
目的 研究ESAT6、CFP10基因DNA疫苗分别与卡介苗联合免疫小鼠,以诱导免疫效果.方法 以构建的真核表达载体pEGFP-N1ESAT6、pEGFP-N1-CFP10与卡介苗共同免疫随机分成8组的80只小鼠,分别标记为:生理盐水组(SLYS)、卡介苗组(KJM)、pEGFP N1组(P-N1)、pEGFP-N1 ESAT6组(P-N1-E)、pEGFP N1-CFP10组(P-N1-C)、卡介苗加pEGFP-N1组(K+P-N1)、卡介苗加pEGFP-N1-ESAT6组(K+P-N1-E)和卡介苗加pEGFP-N1 CFP10组(K+P-N1-C).每只小鼠皮内注射100μL卡介苗,每只小鼠肌肉注射50μg质粒,每组共注射3次.以纯化的ESAT6、CFP10蛋白作为抗原,用DOT ELISA方法检测小鼠血清中的抗体;用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ的变化.结果 免疫3次后的小鼠血清中检测到针对CFP10蛋白的抗体,未检测到针对ESAT6蛋白的抗体.但二者血清中IFNγ水平都有显著上升,K+P N1-C和K+P-N1-E免疫3次后,测得的IFN-γ平均含量为(107.591±7.3281)pg/mL和(95.7503±9.0184) pg/mL,显著高于免前、一免、二免(P＜0.01).结论 结核分枝杆菌ESAT6,CFP10基因DNA疫苗和卡介苗联合应用后可诱导小鼠产生有效的细胞免疫应答,为DNA疫苗的研究奠定一定的基础.
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ESAT6和CFP10融合蛋白抑制巨噬细胞自噬体形成的实验研究
目的 观察ESAT6和CFP10融合蛋白对感染MTB的巨噬细胞自噬体形成的抑制作用.方法 雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞自噬体形成后,用MTB毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用25μg/mL的ESAT6-CFP10融合蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总RNA和蛋白,以RT-PCR和免疫印迹方法检测自噬相关基因(atg)表达水平的变化.结果 ESAT6-CFP10融合蛋白后可抑制巨噬细胞中自噬体的形成,显著提高CFU指数(P＜0.05),并导致atg分子表达水平下降,其中atg8表达量下降为明显(P＜0.05).结论 ESAT6和CFP10融合蛋白可通过调控atg表达水平影响巨噬细胞自噬功能.
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结核分枝杆菌Ag85B与ESAT6融合蛋白的表达、纯化及抗原活性的初步研究
目的 将结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B与ESAT6在大肠杆菌中融合表达,并对其进行纯化、鉴定和免疫学特性的初步研究.方法 采用PCR方法 从MTB毒株H37Rv基因组DNA中扩增Ag85B和ESAT6基因,并在两基因中引入48bp的柔性linker结构,以确保两蛋白的正确折叠.将各目的 片段克隆至pMD18-T载体中进行测序.将测序正确的目的 基因片段双酶切后亚克隆至原核表达载体pPro-EXHTa,得到重组质粒pPROEXHTa-Ag85B-ESAT6,并转化入大肠杆菌DH5α.经IPTG 诱导后进行融合表达,并分别用抗Ag85B和抗ESAT6的mAb进行Western blot分析鉴定.通过镍柱对融合蛋白进行纯化.在PBS中通过透析恢复重组蛋白的天然结构,将复性融合蛋白与8例临床可疑结核病人血清进行ELISA测定.结果 PCR法扩增获得的各目的 基因片段与GenBank报道的一致.构建的融合蛋白原核表达载体在大肠杆菌中表达后,经SDS-PAGE 分析显示重组质粒在原核系统中得到了表达.融合蛋白能够分别与抗Ag85B和抗ESAT6的mAb反应.该融合蛋白主要以包涵体的形式存在,镍柱亲和层析纯化后得到了高纯度的Ag85B-ESAT6融合蛋白,并能够与结核病人血清发生反应.结论 结核分枝杆菌融合蛋白Ag85B-ESAT6在大肠杆菌中得到了高效表达,为进一步研究其免疫原性和保护性提供了基础.
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结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因稳定表达细胞系的建立
目的筛选并建立稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10 融合基因的P815细胞株,为结核杆菌DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法以BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切pGEM610获得esat6-cfp10融合基因,克隆入真核表达载体pCDNA3.1(+),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染P815细胞,多轮筛选过后分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pCDNA610,RT-PCR结果证明esat6-cfp10融合基因已稳定整合在转染P815细胞染色体上,间接免疫荧光检测后表达有ESAT6-CFP10蛋白的阳性细胞着染.结论获得了稳定表达结核分枝杆菌esat6-cfp10融合基因的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测结核杆菌DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.
