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EPEC O2、O78及融合双价弱毒菌株O2,78(Chlr Norr)ompA基因原核表达载体重组构建
目的 构建PThioHisA-ompA重组质粒. 方法 根据GenBank中大肠埃希菌K-12外膜蛋白A基因的核苷酸序列设计引物,从大肠埃希菌O2、O78及其融合株O2,78(ChlrNorr)中分别扩增得到外膜蛋白A基因(ompA)序列,进行序列测定及分析.重组PMD-18-ompA经双酶切切下ompA片段,电泳回收;原核表达载体PThioHisA质粒双酶切,回收大片段.再将回收的ompA插入回收大片段原核表达载体PThioHisA上. 结果 按预期PThioHisA-ompA重组质粒PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在约1 kb处有一清晰条带,与预期值相符. 结论 成功构建PThioHisA-ompA重组质粒,为致病性大肠埃希菌基因疫苗的抗原筛选和构建奠定了实验基础.
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构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体
目的:构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体,并对其进行克隆表达.方法:实验于2004-12/2005-12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成.以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,PCR扩增Loa22基因去信号肽片段,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,经双酶切、PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒克隆.经DNA测序正确后,转化大肠杆菌,利用IPTG进行诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定表达产物.结果:PCR获得长516 bp的片段.Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功.重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45 000的融合蛋白.结论:制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体,为钩体新型疫苗的研究奠定基础.
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鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpA的原核表达及保守性分析
目的:扩增鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)外膜蛋白OmpA基因,表达纯化该蛋白,为深入研究鲍曼不动杆菌亚单位蛋白疫苗奠定理论基础.方法:从ATCC19606提取OmpA基因,构建pET28a(+)-OmpA 表达载体,用BL21诱导表达并纯化蛋白;选取20株临床菌株,PCR技术扩增OmpA基因,免疫印迹试验(Western blot) 验证OmpA蛋白保守性.小鼠腹腔细菌攻毒后生存率观察验证疫苗保护性.结果:成功构建pET28a(+)-OmpA质粒,表达并纯化蛋白;20株鲍曼不动杆菌均扩增出OmpA基因;Western blot 实验表明临床菌株OmpA蛋白表达阳性.攻毒后,免疫小鼠较对照组生存率明显增加.结论:OmpA基因和蛋白表达保守性高,具有免疫原性,是鲍曼不动杆菌疫苗良好的抗原靶点.
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问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究
目的 克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义.方法 生物信息学软件分析预测LA0301的特征.构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDs-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况.用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性.酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体.结果 生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域.克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/e小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000.在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白.结论 LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体.为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础.
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泌尿生殖道沙眼衣原体MLVA-ompA分型方法的建立及初步应用
目的:探讨泌尿生殖道沙眼衣原体(Ct)多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)-ompA分型方法的建立及初步应用.方法:共对5株Ct参考株和31株性病门诊男性Ct阳性株进行MLVA-ompA分型.合成针对串联重复次数差异性显著的3个可变数目串联重复序列(VNTR)(CT 1291,CT1299,CT 1335)的引物,优化PCR反应条件,进行PCR扩增,与参考序列比对进行MLVA分型.OmpA分型采用本实验室已建立的巢式PCR方法,扩增ompA基因,通过测序后进行Blast比对判断型别.结果:ompA和MLVA分型方法的分辨率分别为0.83和0.86,MLVA-ompA分型分辨率可达0.96.31株临床Ct株中,29例(93.5％)ompA分型成功,共被分为8个基因型B(0.7％)、D(37.9％)、E(0.7％)、F(10.3％)、G(0.7％)、H(0.7％)、J(20.7％)、K(3.4％).31株临床Ct株MLVA分型全部成功(100％),共检出10个MLVA亚型和18个MLVA-ompA亚型.结论:成功建立了Ct的MLVA-ompA分型方法,该方法可对临床Ct阳性株进行分型分析,与ompA分型方法相比,具有更高分辨率,可作为Ct传统分型方法的补充.
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鹦鹉热嗜衣原体分型的研究进展
鹦鹉热嗜衣原体广泛分布于世界各地,能感染禽鸟、哺乳动物及人类,严重威胁人类健康,并对世界各国的禽类养殖业造成巨大影响.传统的血清学分型法由于其特异性低、敏感性差等缺点几乎已被淘汰,随着分子生物学技术的发展,基因分型法凭借其高特异性、高敏感性、高分辨率等优点,有效地弥补了血清学分型的不足.本文就Cps分型方法的研究进展进行了综述.
