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Akt特异性抑制剂MK2206诱导U937及RS4;11细胞凋亡及其机制
目的:本研究探讨Akt激酶抑制剂MK2206对U937及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制.方法:以不同浓度MK2206处理U937及RS4;11细胞24、48 h,用CCK-8法绘制细胞增殖曲线;AnnexinV/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记法分析细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞周期的变化;实时定量PCR检测Bax、Bcl-2、XIAP、CDK1、caspase-3基因mRNA表达的变化.结果:MK2206对U937及RS4;11细胞增殖具有抑制作用,且抑制效应呈一定的时间和剂量依赖性,U937细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.48±0.15)和(0.09±0.01) μmol/L,RS4;11细胞24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.91±0.02)和(0.68±0.11) μmol/L.0.5 μmol/L MK2206作用于U937细胞及1.0 μmol/L MK2206作用于RS4;11细胞24 h、48 h,AnnexinV/7-AAD标记的阳性细胞升高,U937细胞组24 h细胞凋亡率为(4.18±0.70)％,48 h细胞凋亡率为(22.53 ±4.67)％,均高于对照组的(1.35±0.34)％(P＜0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P＜0.05);RS4;11细胞组24 h和48 h细胞凋亡率分别为(5.74±0.58)％和(10.07±1.24)％,均高于对照组的(1.32±0.31)％(P＜0.05),且48 h细胞凋亡率较24 h更为明显(P＜0.05).流式细胞术检测细胞周期结果显示,U937细胞组G2/M期细胞比例为(96.78±9.11)％,高于对照组的(9.64±0.91)％(P＜0.05);RS4;11细胞组G2/M期细胞比例为(14.19±3.82)％,高于对照组的(5.75±1.28)％(P＜0.05).荧光定量PCR检测结果示,两种细胞中Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平升高,而Bcl-2、XIAP表达水平降低,同时伴CDK1 mRNA水平的减少,与各自对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:MK2206能有效抑制U937及RS4;11细胞增殖及促进细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达、下调Bcl-2与XIAP基因表达有关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平下降有关.
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依鲁替尼与达沙替尼对急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制及其机制实验研究
目的:研究Btk抑制剂PCI-32765(依鲁替尼)和酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂Dasatinib(达沙替尼)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞(Sup-B15、RS4;11)增殖、凋亡的影响,为其用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗提供实验依据.方法:PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药处理Sup-B15与RS4;11细胞后,用CCK-8法检测细胞的凋亡,刘氏染色法观察对细胞形态变化,Western blot法检测PCI-32765和Dasatinib对Btk上下游信号分子表达及活性的影响.结果:PCI-32765对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,Sup-B15细胞对其敏感性高于RS4;11,IC50值分别为3和8μmol/L(P ＜0.05).Dasatinib对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用也呈剂量依赖性,IC50值分别为5μmol/L和5 nmol/L,相差1 000倍(P＜0.01).Dasatinib与PCI-32765联用后,增殖抑制作用明显增强(P＜0.05).PCI-32765和Dasatinib分别作用RS4;11和Sup-B15细胞8、12、24、36、48和72 h,PCI-32765与Dasatinib单药组及联合用药组的细胞存活率均逐渐降低,且两药具有协同作用,呈时间依赖性.PCI-32765或/和Dasatinib处理的RS4;11和Sup-B15细胞体积缩小,细胞质密度增加,核固缩、核偏位、核碎裂,但小剂量Dasatinib单药对RS4;11细胞凋亡促进不明显,联合用药组凋亡细胞增多.PCI-32765或/和Dasatinib处理Sup-B15细胞BCR-ABL、Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关;RS4;1 1细胞Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关.结论:PCI-32765或Dasatinib均可明显抑制Sup-B15和RS4;11细胞增殖,诱导其凋亡,且有协同作用.其作用机制可能与通过活化B细胞受体(B cell receptor,BCR)信号通路、促进细胞凋亡有关.
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溴结构域蛋白4抑制剂GSK525762A对急性B淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的影响及可能机制
目的 探究溴结构域蛋白4(BRD4)抑制剂对急性B淋巴细胞白血病细胞生物学行为的影响及可能机制.方法 用BRD4抑制剂GSK525762A抑制急性B淋巴细胞白血病细胞株RS4; 11细胞BRD4活性,并以急性T淋巴细胞白血病细胞株Jurkat细胞作对照.采用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用Annexin Ⅴ/7-AAD标记,流式细胞术检测细胞凋亡;荧光定量PCR检测抗凋亡基因c-myc、Bcl-2、CDK6和促凋亡基因Bad、Bak、Bax的转录水平;Western blot检测Bcl-2及Bak蛋白的表达.结果 不同浓度GSK525762A对RS4; 11细胞增殖均有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性,作用48、72 h其半数抑制率分别为6.174和1.996 μmol/L.与DMSO处理组比较,GSK525762A处理后RS4; 11细胞c-myc、Bcl-2、CDK6mRNA转录水平降低,而Bad、Bak、Bax mRNA转录水平升高,且Bcl-2蛋白表达水平下调,Bak蛋白表达水平上调.而GSK525762A对Jurkat细胞的增殖抑制作用并不明显.结论 GSK525762A可抑制RS4; 11细胞的增殖,并促进其凋亡;该作用可能通过下调Bcl-2表达,诱导白血病细胞凋亡而实现的.
关键词： 溴结构域蛋白4抑制剂 RS4 11细胞 细胞增殖 -
26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat及RS4;11细胞增殖、凋亡的影响及凋亡机制的研究
目的 探讨26S蛋白酶抑制剂b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖及细胞凋亡的影响,并分析其作用机制.方法 无菌条件下对Jurkat细胞与RS4;11细胞进行培养,根据有无b-AP15处理,将其分为4组:①Jurkat细胞实验组;②Jurkat细胞对照组;③RS4;11细胞实验组;④RS4;11细胞对照组.其中,Jurkat细胞实验组与RS4;11细胞实验组采用浓度分别为0.05,0.10,0.50,1.00,5.00 μmol/L b-AP15处理24,48 h;Jurkat细胞对照组与RS4;11细胞对照组采用RPMI 1640培养基进行同步培养.采用CCK-8法绘制4组细胞增殖曲线;采用Annexin Ⅴ-别藻蓝蛋白(APC)/7-氨基放线菌素D(7-AAD)双标记流式细胞术检查4组细胞凋亡情况;采用流式细胞术检测细胞4组细胞周期分布情况;采用实时定量PCR检测4组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2相关Ⅹ蛋白(Bax)基因、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2基因、Ⅹ连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)、周期素依赖性激酶(CDK)1基因及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3基因mRNA表达水平.结果 ①b-AP15对Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖均具有抑制作用,且该抑制效应呈时间与剂量依赖性;Jurkat细胞经b-AP15处理24,48 h后,半数抑制浓度(IC50)分别为(1.52±0.35)μmol/L与(0.54±0.01) μmol/L,RS4;11细胞经b-AP15处理24,48 h后IC50分别为(0.97±0.02)μmol/L与(0.08±0.03)μmol/L.②使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组后,其与Jurkat细胞对照组相比细胞凋亡率显著增高,且差异有统计学意义(P＜0.001);使用浓度为1.0 μmol/Lb AP15处理RS4;11细胞实验组后,其与RS4;11细胞对照组相比细胞凋亡率亦显著增加,且差异亦有统计学意义(P＜0.001);且Jurkat细胞与RS4;11细胞经b-AP15处理48 h后,与处理24 h后者相比细胞凋亡率增高,且差异均有统计学意义(t=11.887,7.449;P＜0.001).③与Jurkat细胞对照组相比,使用浓度为1.5 μmol/L b-AP15处理Jurkat细胞实验组24 h后,Jurkat细胞周期明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=10.672,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=19.053,P＜0.05).与RS4;11细胞对照组相比,使用浓度为1.0 μmol/L b-AP15处理RS4;11细胞实验组24 h后,RS4;11细胞周期亦明显被阻滞于G2/M期,且差异有统计学意义(t=13.643,P＜0.05);同时伴S期细胞比例减低,且差异亦有统计学意义(t=6.992,P＜0.05).④使用b-AP15处理Jurkat细胞与RS4;11细胞24 h后,荧光定量PCR检测结果显示,凋亡相关基因Bax、caspase-3 mRNA相对表达水平增高,Bcl-2、XIAP mRNA相对表达水平减低,同时伴细胞周期相关基因CDK1 mRNA相对表达水平减低,与各自细胞对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05);且RS4;11细胞实验组caspase-3 mRNA相对表达水平较Jurkat细胞实验组相比,增高程度更为显著,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 b-AP15能有效抑制Jurkat细胞与RS4;11细胞增殖,并促进其细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2/M期,其促凋亡机制与上调Bax与caspase-3基因表达水平、下调Bcl-2与XIAP基因表达水平相关,细胞周期G2/M期阻滞与CDK1基因表达水平减低相关.
