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黄芩苷抗丙型肝炎病毒的活性研究
目的 研究黄芩苷抗丙型肝炎病毒(HCV)的活性.方法 在体外无细胞系统中应用荧光共振能量转移法检测黄芩苷对HCV NS3/4A蛋白酶和NS3解旋酶的抑制活性;在Huh7.5细胞培养内分析其对野生型及临床常见耐药型HCV感染的抑制作用,并考察与目前临床应用的抗病毒药物联合抗HCV的活性.结果 黄芩苷具有抑制HCV NS3/4A蛋白酶活性,但对NS3解旋酶无抑制作用.细胞培养内抗HCV活性测定显示,黄芩苷抑制野生型HCV复制的半数抑制浓度(EC50)为(31.306±9.559)μmol/L,抑制蛋白酶抑制剂常见耐药突变A156T和D168V突变HCV复制的EC50分别为(53.175±19.141)μmol/L和(66.722±30.994)μmol/L,抑制多聚酶抑制剂常见耐药突变S282T突变HCV复制的EC50为(63.673±19.770)μmol/L.黄芩苷与多聚酶抑制剂索非布韦联用还具有协同抗病毒效果,但与具有相同作用机制的西咪匹韦联用有拮抗作用.结论 黄芩苷具有抗HCV作用,其机制为抑制HCV蛋白酶,对蛋白酶抑制剂常见耐药突变病毒有效,与多聚酶抑制剂联用有协同抗病毒作用.
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免疫调理治疗改善脓毒症炎症因子、体液和细胞免疫以及预后的作用
目的 研究免疫调理治疗改善脓毒症炎症因子、体液和细胞免疫功能以及预后的作用.方法 前瞻性分析70例符合脓毒症患者,随机分成对照组和治疗组,对照组接受常规治疗,治疗组行常规治疗联合使用蛋白酶抑制剂和胸腺肽α1治疗(常规治疗+免疫调理),免疫调理疗程为7 d,分别观察治疗前和治疗后第1、3、7天相关免疫学指标,并收集临床资料和预后情况.结果 脓毒症患者免疫调理炎症因子的分析,治疗组TNF-α降低比对照组明显,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);治疗组IL-8与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗组IL-10升高比对照组明显,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).脓毒症患者免疫调理体液免疫的分析,治疗组的IgG水平比对照组有所提高,两组差异有统计学意义(P<0.05);治疗组补体C3和补体C4水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05).脓毒症患者免疫调理细胞免疫的分析,治疗组CD4+T淋巴细胞比对照组明显升高,两组差异有统计学意义(P<0.05).住院期间,对照组死亡20例,治疗组死亡13例,两组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 脓毒症患者免疫调理可以明显降低促炎因子TNF-α水平,升高抗炎因子IL-10水平,轻度提高体液免疫中IgG水平,升高细胞免疫中CD4+T淋巴细胞数,增加脓毒症患者的住院生存率.
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既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir天然耐药分析
目的：分析既往有偿献血人群HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir的天然耐药，为HCV的耐药监测及临床抗病毒治疗提供基础数据。方法收集既往有偿献血人群HIV阳性患者的血浆样本，检测其HCV抗体，应用巢式PCR扩增HCV NS3/4A区，对测序结果进行耐药分析，计算耐药率，评价耐药毒株的流行趋势。结果从150份符合要求的样本里共获得70份（46.67%）HCV NS3/4A基因序列。检测出耐药相关突变4例（5.71%），其中对boceprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H和A156V；对telaprevir耐药2例（2.86%），耐药位点为R117H和A156V；对telaprevir可能耐药2例（2.86%），耐药位点为T54S。尚未发现V36A/M/L/C、Q41H/R、F43C/S、T54A、V55A、Q80R、R109K、S138C、R155G/I/K/M/T/Q/S、A156S/T、D168A/E/G/H、V170A/T/I、N174G/S、L175M等已报道的耐药位点。其他突变中，氨基酸替换率超过90%的变异位点有I35V、A40T、R62K、I64L、V71I、S66G、S91A和T42S；在系统进化树中，耐药序列呈点状散在分布，未发现聚集性。结论既往有偿献血HIV-1感染者中合并感染的HCV对telaprevir和boceprevir存在天然耐药，耐药相关突变率分别为5.71%和2.86%。其他氨基酸位点出现突变率较高，但是未发现与耐药相关。各耐药菌株之间未发现传播关联性。
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慢性丙型肝炎抗病毒治疗研究新进展
基于长效干扰素和利巴韦林(ribavirin,RBV)的经典抗HCV疗法不良反应较大,疗效有待进一步提高.近年来抗HCV药物研发取得较快发展,以直接抗病毒药物(direct-acting antivirals,DAA)的研发为活跃,在此基础上产生了多种新的抗HCV治疗策略.其中,针对病毒不同靶位的DAA联合治疗初露锋芒,Ⅱ期临床试验表明,不用干扰素,甚至不用RBV的DAA联合治疗可取得很好疗效,24周治疗后持续病毒学应答率高可达100％,疗效可不受HCV基因型和患者IL-28B分型影响,患者耐受性通常良好.因此DAA联合治疗方案是今后治疗丙型肝炎的发展趋势.
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钙蛋白酶与肝移植缺血/再灌注损伤关系的实验研究
目的探讨大鼠肝脏在不同冷缺血期、复温期及再灌注期钙蛋白酶活性变化以及钙蛋白酶抑制剂对离体灌注肝功能及原位肝移植大鼠生存的影响.方法 SD大鼠.实验分组:①冷缺血组(n=6);②不同冷缺血期后复温组(n=30);③不同冷缺血期后/再灌注组(n=24);④钙蛋白酶抑制剂组(n=12);⑤原位肝移植组(n=20).结果冷缺血12 h始,肝组织中钙蛋白酶活性明显增加(P<0.05).24小时点增加显著(P<0.01).不同冷缺血期后复温30min时,各组钙蛋白酶活性均明显增加(分别P<0.05).60min时增加显著(分别P<0.01).冷缺血24 h后再灌注30min,钙蛋白酶活性开始明显增加(分别P<0.05),而0 h和12 h冷缺血组再灌注60min后钙蛋白酶活性才开始明显增加(分别P<0.05).钙蛋白酶抑制剂可明显地降低离体灌注肝AST水平及增加胆汁量(分别P<0.01),同时可明显地增加肝移植大鼠7 d生存率(P<0.05).结论肝移植冷缺血期、复温期及再灌注期钙蛋白酶活性均明显增加.钙蛋白酶抑制剂可明显地改善移植肝功能及移植动物的生存期.钙蛋白酶可能是肝移植缺血/再灌注损伤的重要因子.
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3,4＇,5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷对大肠癌细胞系蛋白激酶C的抑制效应
目的研究3,4',5-三羟基芪-3-β-单-D-葡萄糖苷(3,4',5,-trihydroxystibene-3-β-mono-D-glucoside,THMG)对大肠癌细胞粘附性、浸润力及蛋白激酶C活性的影响;探讨THMG抗转移作用的信号转导机制.方法利用Boyden小室法等细胞生物学技术检测4种大肠癌细胞(HR8348,Hce-8693,HT29,LoVo)在0.4,0.8,1.6和3.2 mmol@L-1等浓度THMG作用下的粘附率、浸润力.[γ-32P]ATP掺入法测定蛋白激酶C活性.结果在3.2mmol@L-1浓度时THMG对HR-8348,Hce-8693,HT-29和LoVo粘附抑制率分别为75.7%,69.4%,67.6%和78.8%,浸润抑制率分别为82.7%,85.7%,89.7%和92.7%,且随着浓度加大,粘附和浸润抑制率提高.3.2 mmol@L-1THMG对HR-8348,Hce-8693,HT-29和LoVo的蛋白激酶C活性抑制率分别是35.1%,36.8%,41.5%,49.6%,呈剂量依赖性关系,与对照组比较具有统计学显著性(P＜0.001).粘附性及浸润力抑制程度与蛋白激酶C活性的抑制程度呈显著性相关(P＜0.05).结论 THMG可能通过抑制蛋白激酶C活性对信号转导系统具有调变作用,THMG对信号转导系统的影响可能是抗粘附抗侵袭效应的重要机制之一.
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蛋白酶体抑制剂MG-132阻碍破骨细胞分化成熟的研究
目的 探讨蛋白酶抑制剂MG-132对破骨细胞分化成熟过程的影响. 方法分离、培养新生兔四肢长骨破骨细胞,实验分4组:对照组、MG-132 0.001 mmol/L培养组、0.01 mmol/L培养组及0.1 mmol/L培养组.于培养第2、5、8 d取细胞玻片、皮质骨片进行HE、甲苯胺蓝、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,光镜下观察染色阳性细胞和骨片吸收陷窝,扫描电镜下观察吸收陷窝形态. 结果 (1)与对照组(第5天:46.8±3.4,第8天:34.64±4.1)比较,MG-132 0.001 mmol/L培养组、0.01 mmol/L培养组及0.1 mmol/L培养组破骨细胞计数在培养5 d后明显降低,分别为40.4±4.6(P＜0.05)、38.4±3.9(P＜0.05)、31.9±5.6(P＜0.01);(2)破骨细胞计数与蛋白酶抑制剂MG-132浓度呈负相关(r=-0.342,P＜0.01);(3)与对照组比较,MG-132 0.01 mmol/L培养组及0.1 mmol/L培养组骨片骨陷窝计数在培养第2、5、8天时,均明显减少(P＜0.05),0.001 mmol/L培养组与对照组比较差异无统计学意义. 结论 蛋白酶抑制剂MG-132可阻碍破骨细胞的分化成熟,抑制其蚀骨作用,并呈剂量依赖性.
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胰蛋白酶在脓毒症大鼠模型血清及组织中的表达及意义
目的 探讨胰蛋白酶在脓毒症大鼠血清和组织中的表达及意义.方法 采用随机数字表法将雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、脓毒症模型组、乌司他丁干预组,每组6只.脓毒症模型组大鼠尾静脉推注脂多糖复制脓毒症模型,乌司他丁干预组大鼠复制脓毒症模型1h后缓慢静脉推注乌司他丁50 000 U/kg.免疫印迹法检测3组大鼠空肠组织中胰蛋白酶、黏蛋白2和E-钙黏蛋白表达.检测3组大鼠血清和组织中胰蛋白酶水平、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-6(IL-6)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE),并行相关性分析.结果 脓毒症模型组大鼠血清[(73.71±9.14)ng/ml比(12.12± 2.36)ng/ml]、心组织[(51.60±15.06)ng/ml比(6.39±3.53)ng/ml]、肺组织[(54.73±5.57)ng/ml比(5.24±3.08) ng/ml]、空肠组织(1.19±0.48比0.40±0.12)胰蛋白酶水平较空白对照组显著增高(P值均<0.05);脓毒症模型组的血清胰蛋白酶水平与其空肠组织的黏蛋白2、E-钙黏蛋白水平呈负相关(r值分别为-0.926、-0.954,P值均<0.05),与其血清TNFα、IL-6、NE呈正相关(r值分别为0.936、0.835、0.784,P值均<0.05).与脓毒症模型组比,乌司他丁干预组胰蛋白酶[血清:(65.79±4.88)ng/ml;心组织:(26.33± 12.03)ng/ml;肺组织:(28.73±14.46)ng/ml;空肠组织:0.80±0.20]、血清TNFα[(247.34±16.97)ng/L比(178.78±40.81)ng/L]、血清IL-6[(37.60±6.24)pg/ml比(23.30±1.55)pg/ml]水平显著下降(P值均<0.05),空肠组织黏蛋白2(0.58±0.14比0.89±0.17)、E-钙黏蛋白(0.11±0.04比0.23±0.06)表达显著增加(P值均<0.05).结论 胰蛋白酶在脓毒症大鼠血清及组织中表达明显增加,使用蛋白酶抑制剂乌司他丁可能起到肠道保护及减轻全身炎症的作用.
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骨髓干细胞移植通过基质金属蛋白酶及其抑制剂降低大鼠缺血性心力衰竭心室重构
目的 探讨骨髓干细胞通过调节基质金属蛋白酶2/基质金属蛋白酶抑制剂1(MMP2/TIMP1)系统改善急性心肌梗死后心力衰竭心室重构.方法 结扎雌性SD大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死模型.4周后随机分为2组:移植组大鼠7只,移植雄性SD大鼠来源的骨髓干细胞(5×106)到梗死后瘢痕区.对照组大鼠7只,移植等体积的PBS到瘢痕心肌.通过HE染色和Masson染色评价左室形态.免疫组织化学分析心肌MMP2和TIMP1和瘢痕区Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况.经Western杂交检测MMP2和TIMP1蛋白变化.结果 部分骨髓干细胞在移植后21天呈纤维母细胞样生长.移植后早期有炎症细胞聚集在瘢痕区,移植后7天炎症细胞减少.与对照组相比,移植组大鼠左室射血分数和左室短轴缩短率提高[(63.43±3.97)%与(36.20±3.99)%,(31.71±1.98)%与(18.00±2.07)%,P＜0.05],左室压力下降大值(dp/dtmin)降低[(-4756.24±270.00)mm Hg/s(1 mm Hg=0.133 kPa)与(-2789.53±624.13)mm Hg/s,P＜0.05],左室厚度率增加[(76.34±2.66)%与(64.37±2.36)%,P＜0.05],梗死区面积缩小[(36.19±0.83)%与(42.12±1.88)%,P＜0.05].移植组大鼠瘢痕区Ⅰ型胶原表达升高,Ⅲ型胶原降低;心肌MMP2蛋白水平降低而TIMP1水平升高.结论 骨髓干细胞移植通过MMP2/TIMP1导致胶原网络的动态变化,从而改善急性缺血后衰竭心脏的左室重构.
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风湿性心房颤动患者calpain-Ⅰ/calpastatin和caspase-3与细胞凋亡的关系及其作用
目的检测在风湿性心脏病心房颤动(房颤)患者左心房中calpain-Ⅰ、calpastatin和caspase-3的含量以及细胞凋亡的发生率,探讨它们之间的相互关系,研究它们在房颤发病机制中的作用.方法选择接受外科换瓣手术的风湿性心脏病患者共43例,分为三组;其中窦性心律组15例,阵发性房颤(阵发房颤)组8例,永久性房颤(永久房颤)组20例.在外科手术中取左心房组织,应用免疫印迹法测定各组患者的calpain-Ⅰ、calpastatin和caspase-3的蛋白含量;应用TUNEL法检测各组患者左心房肌细胞凋亡,计算其凋亡指数(AI),分析比较它们之间的关系.结果与窦性心律组比较:(1) 永久房颤组的calpain-Ⅰ含量增加到(344.0±101.9)%,caspase-3含量增加到(394.0±99.4)%(P《0.01),calpastatin含量降低到(27.0±12.8)%(P《0.01);而阵发房颤组的各蛋白含量则无明显变化;(2)永久房颤组左心房心肌细胞AI为(24.6±9.1)%,明显升高(P《0.01);(3)在永久房颤组中,calpain-Ⅰ和caspase-3的蛋白含量及AI分别与左心房内径、房颤持续时间呈明显正相关(P《0.05～0.01);calpastatin的蛋白含量却分别与两者呈明显负相关(P=0.007,P=0.001);(4)calpain-Ⅰ的含量分别与caspase-3的含量、AI呈明显正相关(均为P 《0.01);而calpastatin的含量分别与calpain-Ⅰ、caspase-3的含量明显负相关(均为P《0.01).结论永久房颤时,左心房组织心肌细胞凋亡增加,calpain-Ⅰ、caspase-3、calpastatin蛋白表达出现变化,并且它们之间关系密切、相互影响,可能形成一个体系,使心房结构和功能改变,促使房颤发生和持续存在,可能是房颤发病的重要机制之一.
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钙激活蛋白酶Ⅰ抑制剂对快速起搏犬心房结构重构的影响
目的 观察钙激活蛋白酶Ⅰ(calpain Ⅰ)抑制剂对长期心房快速起搏致心房颤动犬的心房结构重构的影响.方法 杂种犬15只,分为假手术组、起搏组、抑制剂组各5只.于犬右心耳缝置电极,起搏3周(600 次/min).起搏后抑制剂组每日给以calpain Ⅰ抑制剂N-Acetyl-Leu-Leu-Met (ALLM)1.0 mg·kg-1·d-1静脉注射,起搏组和假手术组给予等量溶剂二甲亚砜.采用荧光光度法测定心房肌calpain Ⅰ活性,光镜观察肌溶解程度,电镜观察超微结构的变化,Western blot技术测定心肌肌钙蛋白T蛋白含量,超声测定左心房容积的变化.结果 起搏3周后,起搏组calpain Ⅰ活性增加至假手术组的2.3倍(P＜0.01),抑制剂组calpain Ⅰ活性为假手术组的1.1倍(P＞0.05);起搏组左心房肌溶解的比率为(76.7±5.9)%,抑制剂组左心房肌溶解的比率为(20.8±8.1)%,两组比较,P＜0.01.calpain Ⅰ活性与肌溶解的比率呈高度正相关(r=0.89).肌钙蛋白T蛋白含量在抑制剂组高于起搏组(P＜0.01).抑制剂组左心房容积的变化较起搏组显著减轻.结论 ALLM通过抑制心房快速起搏犬心肌calpain Ⅰ活性,防止了心房肌结构的改变,为心房颤动后心肌的保护提供了一种可能的有效途径.
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新型基质金属蛋白酶抑制剂MMI-166对裸鼠胰腺癌移植瘤作用的研究
目的 观察新型选择性基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂MMI-166对裸鼠人胰腺癌细胞SW1990移植瘤生长及瘤内MMP-2、MMP-9蛋白表达和细胞凋亡的影响.方法 应用人胰腺癌细胞株SW1990建立裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型.裸鼠随机分为对照组和实验组.对照组口服生理盐水,实验组口服MMI-166(200 mg·kg-1·d-1).游标卡尺测量肿瘤的长、短径,比较两组间肿瘤体积、抑瘤率.采用免疫组织化学测定肿瘤组织内MMP-2、MMP-9蛋白的表达.利用脱氧核苷酸末端转移酶介导缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数(AI).结果 研究结束后,实验组移植瘤肿瘤体积为(1252.30±464.84)mm3,明显小于对照组移植瘤肿瘤的(2241.82±208.06)mm3;实验组瘤体重(1.42±0.15)g,低于对照组的瘤体重[(2.17±0.20)g]；实验组抑瘤率为34.47％.实验组内蛋白MMP-2和MMP-9的表达分别为(2.80±1.10)、(2.60±1.52),与对照组相比显著降低；细胞凋亡指数在实验组为(75.60±9.71)％,显著高于对照组的(17.40±10.14)％.结论 MMI-166可抑制胰腺癌肿瘤的生长并诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达有关.
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硼替佐米联合顺铂对卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞化疗敏感性的影响
目的 研究蛋白酶体抑制剂--硼替佐米联合顺铂作用于卵巢上皮性癌(卵巢癌)顺铂耐药细胞的效果,并探讨其诱导细胞凋亡的分子学机制.方法 实验分组:硼替佐米(50 nmol/L)+顺铂(40μmol/L)、硼替佐米(50 nmol/L)、顺铂(40 μmol/L)、对照组(未加药物),以未加药物和细胞,仅加培养基为空白对照(空白组).采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组卵巢癌顺铂耐药细胞株C13细胞培养不同时间(12、24、36、48、60及72 h)后的增殖活性(以细胞存活率表示),膜联蛋白-碘化丙啶双染色法流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;并采用蛋白印迹法检测各组细胞内凋亡抑制蛋白短亚型(cFLIPs)蛋白的表达水平,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(caspase-8)活性检测试剂盒检测各组细胞内caspase-8的活性.结果 硼替佐米+顺铂组细胞显示较好的抑制效果,作用12、24、36、48、60及72 h时其细胞存活率分别为(56.0±8.4)%、(44.7±7.3)%、(33.7±11.2)%、(27.6±8.0)%、(27.6±7.6)%和(28.1±2.4)%,均明显低于顺铂组各时间点(P<0.05).作用24 h时,顺铂、硼替佐米、硼替佐米+顺铂组细胞凋亡率分别为(16.7±l.7)%、(23.4±2.1)%和(26.9±1.6)%,硼替佐米+顺铂组明显高于顺铂或硼替佐米组(P<0.05).各药物处理组细胞内cFLIPs蛋白表达水平均不同程度下降,以硼替佐米+顺铂组[(43.2±2.3)%]降低为明显,分别与顺铂、硼替佐米组[分别为(75.7±3.0)%、(67.9±2.1)%]比较,差异均有统计学意义(P<0.05).顺铂、硼替佐米和硼替佐米+顺铂组细胞内caspase-8活性分别为2.3±1.0、4.2±0.9和5.6±1.6,两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 蛋白酶体抑制剂--硼替佐米联合顺铂能增强卵巢癌顺铂耐药细胞的化疗敏感性;由药物作用后cFLIPs表达的降低和caspase-8活性的增强推测,cFLIPs/capsspe-8信号传导通路在硼替佐米联合顺铂诱导细胞凋亡中发挥了重要作用.
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蛋白酶体抑制剂MG132对卵巢癌作用机制的研究现状
泛素蛋白酶体途径(UPP)和自噬溶酶体途径(ALP)是真核细胞内蛋白质降解的2种重要途径.MG132是一种可逆性肽醛类蛋白酶体(proteasome)抑制剂,可进入细胞中可逆性抑制蛋白酶体活性,抑制UPP介导的蛋白质降解,从而诱导细胞凋亡.自噬性细胞死亡是一种不同于细胞凋亡的程序性死亡,细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的大分子物质和细胞器的生理性细胞死亡过程.卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一.晚期卵巢癌患者的5年生存率约为47％,是妇科恶性肿瘤中导致患者死亡率高的肿瘤.MG132可通过调节凋亡蛋白表达,促进卵巢癌细胞凋亡,但是否可通过调控凋亡、自噬蛋白表达,促进卵巢癌细胞死亡,则迄今文献报道较少.笔者拟就蛋白酶体抑制剂MG132对卵巢癌的作用机制的新研究现状进行阐述,旨在为MG132治疗卵巢癌提供理论基础.
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TRAIL与MG132联合诱导肺癌A549细胞凋亡及机制的探讨
目的:探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)与蛋白酶抑制剂MG132联合诱导细胞凋亡的可能机制.方法:倒置显微镜下观察TRAIL、蛋白酶抑制剂MG132及两药联合干预24 h A549细胞形态学变化；流式细胞仪技术检测TRAIL、蛋白酶抑制剂MG132及两药联合干预24 h A549细胞凋亡指数变化；ELISA方法检测TRAIL、蛋白酶抑制剂MG132及两药联合干预24 h A549细胞NF-kB活性变化；蛋白印迹技术检测TRAIL、蛋白酶抑制剂MG132及两药联合干预24 h A549细胞凋亡基因蛋白Bax及Caspase-3表达水平.结果:倒置显微镜下可观察到两药联合组细胞呈现皱缩、核碎裂等典型的凋亡特征.流式细胞仪技术结果显示TRAIL与蛋白酶抑制剂MG132联合用药干预24 h细胞凋亡率约为48.78％,与单药组(21.12％)相比,凋亡率显著提高,P=0.002；ELISA结果显示TRAIL与MG132联合干预24 h后,细胞NF-κB活性约为0.23,与TRAIL单药组相比活性明显降低,P=0.008；蛋白印迹技术结果显示TRAIL与蛋白酶抑制剂MG132联合用药干预24 h细胞凋亡基因蛋白Bax及Caspase-3表达显著升高,与单药组相比,具有统计学意义,P=0.005.结论:TRAIL联合蛋白酶抑制剂MG132能显著提高细胞的凋亡率,其机制可能与两药联合后降低NF-κB活性、促进凋亡基因蛋白Bax的表达,进而增高Caspase-3表达有关.
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蛋白激酶C抑制剂在防治家兔脑血管痉挛中对核因子-кB的影响
目的探讨蛋白激酶C抑制剂对核因子-кB在实验性家兔脑血管痉挛中表达变化的影响机制及对脑血管痉挛的防治作用.方法中国白兔60只,体重1.5～2 kg,其中45只经枕大池2次(间隔72 h)注入自体动脉血(1 ml/kg)制成脑血管痉挛模型,再随机分为4组:(1)单纯2次注血组(15只);(2)给药组(15只),动物每次经枕大池注血前注射蛋白激酶抑制剂等渗盐水稀释液0.1 ml,剂量为100 μg/kg;(3)等渗盐水组(15只),每次经枕大池注血前注射等量等渗盐水代替蛋白激酶抑制剂;(4)假穿刺组(15只).于第4、7、10天将动物分批处死,取基底动脉进行形态学观察,应用免疫组化、蛋白印迹及电泳迁移率改变分析等方法检测核因子-кB、кB抑制蛋白活性表达变化,评价不同剂量蛋白激酶抑制剂对其影响程度.结果单纯2次注血组家兔较假穿刺组在4～10 d基底动脉出现明显管腔狭窄、炎性浸润等改变,7 d时明显;核因子-кB的活性于4～10 d也明显增高,与炎性变化一致;抑制蛋白кB表达下降,与核因子-кB呈负相关.给药组家兔与单纯注血组相比,基底动脉痉挛程度和炎性浸润明显减轻,抑制蛋白кB表达明显上升,核因子-кB活性下降,而等渗盐水组较单纯注血组则无明显差异.结论蛋白激酶抑制剂不仅能够显著减轻脑血管痉挛的程度,而且可减轻其管壁炎性浸润程度,其作用可能是通过抑制кB抑制蛋白的磷酸化作用减弱核因子-кB的表达来实现的.
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阻断泛素-蛋白酶体通路诱导PC12细胞死亡和泛素阳性包涵体生成
目的探讨泛素-蛋白酶体通路的功能障碍对于多巴胺能细胞的活力以及胞质内包涵体生成的影响.方法应用蛋白酶体抑制剂lactacystin(5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L和20 μmol/L)处理PC12细胞24 h,MTT方法检测细胞活力,Western Blot方法测定细胞内泛素化蛋白质水平,免疫荧光细胞化学染色观察泛素免疫阳性包涵体的生成.结果经5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L和20 μmol/L lactacystin处理24 h后,PC12细胞的活力显著降低(细胞存活率分别为81.5%±3.6%、75.4%±2.4%、70.2%±2.7%和60.4%±3.9%),呈现剂量依赖性.Western Blot证实对照组细胞内未检测到相对高分子质量的泛素化蛋白质;随着lactacystin作用浓度的增加,细胞内相对高分子质量泛素化蛋白质的含量逐渐增高.免疫荧光染色显示对照组中仅有极少数细胞内含有泛素阳性包涵体;20 μmol/L lactacystin处理组中含有泛素阳性包涵体的细胞数目显著增多(P<0.01). 结论泛素-蛋白酶体通路的功能缺失能诱导多巴胺能细胞死亡,造成细胞内泛素化蛋白质积聚,促进胞质内泛素阳性包涵体的生成,可能在帕金森病黑质多巴胺能神经元变性死亡和Lewy小体形成中发挥重要作用.
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硼替佐米对喉鳞状细胞癌细胞的放射增敏作用的体内外研究
目的 探讨蛋白酶抑制剂硼替佐米对喉鳞状细胞癌(简称鳞癌)Hep-2细胞的放射增敏作用及其机制.方法 体外培养的Hep-2细胞在100 nmol/L的硼替佐米作用2 h后,经过0、2、46、8及10 Gy照射后,检测其放射敏感性的变化,并通过建立的裸鼠移植瘤模型验证其体内放射增敏作用.利用Trans AMTM NF-κB P65活性测定试剂盒检测硼替佐米对Hep-2细胞辐射诱导NF-κB活化的影响;用流式细胞仪分析细胞周期及照射前后的细胞凋亡;Hoechst 33342荧光染色法观察细胞凋亡状况.结果 克隆形成实验显示硼替佐米可增加Hep-2细胞的放射敏感性34%.裸鼠移植瘤模型的肿瘤生长延迟放射增敏值为1.46.经2 Gy和8 Gy照射后2 h可诱导NF-κB活化,且存在剂量相关性(r=0.989,P<0.05).硼替佐米在0、2、8 Gy不同的照射剂量均能降低Hep-2细胞NF-κB的活性(t值分别为20.02、14.20、17.46,P<0.01);经硼替佐米干预的细胞有明显的G2-M期阻滞作用(t=22.31,P=0.000),并在照射后明显的细胞凋亡率增加(P值均<0.01).Hoecht 33342染色可见细胞核均匀染色,凋亡细胞的核凝集,呈强蓝色荧光,细胞核碎裂呈花瓣状.硼替佐米照射组凋亡比例高于单纯照射组.结论 硼替佐米通过可影响Hep-2细胞的细胞周期分布、诱导细胞凋亡及抑制NF-κB活化的途径,从而增加其对放射的敏感性.
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蛋白酶抑制剂对内毒素致大鼠急性肺损伤的保护作用
目的:静脉应用蛋白酶抑制剂以了解其对内毒素所致的大鼠肺损伤的保护作用及其机制.方法:雄性Wistar大鼠32只,体重(250～270 g),分为对照组(C,n=8)、内毒素组(A,n=8)、大剂量治疗组(U,n=8)及小剂量治疗组(V,n=8),除对照组外,其他组均给予内毒素(5 mg/kg),治疗组同时给予内毒素和乌司他丁注射(U组100 000 u/kg,V组50 000 u/kg).2 h后测定血清内皮素,进行动脉血气分析,取肺组织观察大体标本形态和光镜下的组织病理形态,测定肺组织血管通透性变化、湿/干质量比值、髓过氧化物酶活性、脂质过氧化产物[丙二醛(malonaldehyde,MDA)和共轭二烯(conjugated-diene,C-diene)].结果:光镜下可见对照组肺组织学正常,内毒素组肺间质弥漫性出血,肺泡腔内可见大量粒细胞聚集、浸润,并可见弥漫性肺泡间隔增厚,而乌司他丁治疗组上述病理表现明显减轻.肺组织湿/干质量比值和每克肺组织伊文思蓝含量在内毒素组分别为(5.41±0.06)和(27.64±2.48)μg,对照组分别为(4.95±0.08)和(12.99±2.83)μg,组间比较差异有统计学意义;U组为(5.0±0.05)和(19.47±2.09)μg;V组为(4.98±0.06)和(21.44±3.12)μg,明显低于内毒素组,U组和V组间差异无统计学意义.血清内皮素及髓过氧化物水平内毒素组分别为(948.23±103.45)u/g和(152.90±8.41)u/g,高于对照组的(729.38±88.64)u/g和(54.62±15.49)u/g,U组为(633.27±93.27)u/g和(119.40±11.32)u/g,V组为(671.87±105.45)u/g和(129.55±9.57)u/g,则低于内毒素组,U组和V组间差异无统计学意义.肺组织脂质过氧化产物水平内毒素组[(MDA(73.95±4.62)nmol/g;C-diene(10.96±0.81)nmol/g]明显高于对照组[MDA(39.65±6.21)nmol/g;C-diene(3.34±0.51)nmol/g],治疗组[U组:MDA(51.26±5.56)nmol/g,C-diene(7.59±0.84)nmol/g;V组:MDA(59.87±4.62)nmol/g,C-diene(8.79±0.45)nmol/g]则较内毒素组明显降低,MDA水平U组低于V组.结论:乌司他丁明显降低肺组织的炎症反应,减轻肺组织的损害,对内毒素所致大鼠肺损伤具有一定的保护作用.
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MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86及对混合淋巴细胞反应的影响
目的 研究蛋白酶体抑制剂MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及其对混合淋巴细胞反应的作用.方法 流式细胞仪检测MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析CD80和CD86 mRNA表达情况;75Gy照射MG132诱导的HL-60细胞后,用CCK-8检测提高共刺激分子表达后,HL-60细胞对健康人单个核细胞的增殖作用.结果 MG132上调HL-60细胞表达CD86,高浓度的MG132对HL-60细胞有直接杀灭作用,MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86后,对健康人单个核细胞起增殖作用.结论 MG132诱导HL-60细胞表达共刺激分子CD86,促进对健康人单个核细胞的增殖作用.
