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4'-羟基汉黄芩素对急性淋巴细胞白血病细胞增殖和凋亡的作用研究
目的:研究4'-羟基汉黄芩素(4'-hydroxywogonin)对急性淋巴细胞白血病细胞株SUP-B15和Jurkat细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法:体外培养SUP-B15和Jurkat细胞,经不同浓度的4'-羟基汉黄芩素处理细胞后,用CCK8法测定4'-羟基汉黄芩素对细胞增殖的抑制作用;Annexin V-APC/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测BCL-2,cleaved caspase-3,C-MYC等蛋白表达情况.结果:4'-羟基汉黄芩素呈剂量依赖性抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖(r=0.78,r=0.89),24 h IC50分别为(6.32±0.53) μg/ml,(12.04±0.42) μg/ml.在梯度药物浓度下,细胞凋亡率增高.Westwm blot检测结果显示,4'-羟基汉黄芩素使凋亡相关蛋白BCL-2表达下调(P＜0.01);cleaved caspase-3表达上调(P＜0.01);细胞增殖相关蛋白C-MYC表达下调(P＜0.01).结论:4'-羟基汉黄芩素可通过抑制SUP-B15和Jurkat细胞的增殖及诱导其凋亡而发挥抗肿瘤作用,其机制可能与下调BCL-2,C-MYC表达,上调cleaved caspase-3蛋白表达有关.
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依鲁替尼与达沙替尼对急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制及其机制实验研究
目的:研究Btk抑制剂PCI-32765(依鲁替尼)和酪氨酸激酶Bcr-abl抑制剂Dasatinib(达沙替尼)对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞(Sup-B15、RS4;11)增殖、凋亡的影响,为其用于Ph+和Ph-ALL靶向治疗提供实验依据.方法:PCI-32765和Dasatinib单药及联合用药处理Sup-B15与RS4;11细胞后,用CCK-8法检测细胞的凋亡,刘氏染色法观察对细胞形态变化,Western blot法检测PCI-32765和Dasatinib对Btk上下游信号分子表达及活性的影响.结果:PCI-32765对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性,Sup-B15细胞对其敏感性高于RS4;11,IC50值分别为3和8μmol/L(P ＜0.05).Dasatinib对RS4;11和Sup-B15细胞的增殖抑制作用也呈剂量依赖性,IC50值分别为5μmol/L和5 nmol/L,相差1 000倍(P＜0.01).Dasatinib与PCI-32765联用后,增殖抑制作用明显增强(P＜0.05).PCI-32765和Dasatinib分别作用RS4;11和Sup-B15细胞8、12、24、36、48和72 h,PCI-32765与Dasatinib单药组及联合用药组的细胞存活率均逐渐降低,且两药具有协同作用,呈时间依赖性.PCI-32765或/和Dasatinib处理的RS4;11和Sup-B15细胞体积缩小,细胞质密度增加,核固缩、核偏位、核碎裂,但小剂量Dasatinib单药对RS4;11细胞凋亡促进不明显,联合用药组凋亡细胞增多.PCI-32765或/和Dasatinib处理Sup-B15细胞BCR-ABL、Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关;RS4;1 1细胞Btk、Lyn、Src表达水平及活性均降低,与药物浓度呈正相关.结论:PCI-32765或Dasatinib均可明显抑制Sup-B15和RS4;11细胞增殖,诱导其凋亡,且有协同作用.其作用机制可能与通过活化B细胞受体(B cell receptor,BCR)信号通路、促进细胞凋亡有关.
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BRD4拮抗剂GSK525762A对SUP-B15细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制
目的:探讨BRD4拮抗剂GSK525762A对费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞株增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法:选择不同浓度的GSK525762A处理SUP-B15细胞,采用CCK-8法检测细胞活力并绘制增殖抑制曲线,应用Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测C-MYC、CDK6、BCL2的转录变化.结果:GSK525762A能显著抑制SUP-B15细胞增殖,且具有量-效关系和时-效关系.GSK525762A能够诱导SUP-B15细胞凋亡;GSK525762A能够使抑凋亡基因C-MYC、CDK6、BCL2表达减低.结论:GSK525762A能抑制SUP-B15细胞增殖并诱导其凋亡,其机制主要与下调C-MYC、CDK6、BCL2转录有关.
关键词： BRD4 GSK525762A 急性淋巴细胞白血病 SUP-B15细胞 -
携带人VE-cadherin基因的慢病毒载体的构建及其在Sup-B15白血病细胞株的表达
本研究旨在构建携带人血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)基因的重组慢病毒载体及探讨VE-cadherin蛋白在Sup-B15细胞中的表达.采用RT-PCR扩增人VE-cadherin基因并克隆至pCR-Blunt载体.将VE-cadherin DNA 片段连入慢病毒转移质粒pLB,生成重组慢病毒质粒pLB-VEC.用三质粒共转染法包装慢病毒,重组慢病毒感染Sup-B15细胞,在光学显微镜下观察细胞状态,用流式细胞术及Western blot法鉴定VE-cadherin蛋白表达.结果表明,成功扩增出人VE-cadherin DNA片段并克隆至pCR-Blunt载体;亚克隆构建慢病毒载体pLB-VEC.经三质粒包装系统包装后获得高滴度慢病毒颗粒,体外可有效感染Sup-B15细胞.感染后细胞发生明显的形态改变,流式细胞术及Western blot检测到VE-cadherin蛋白表达.结论:成功构建携带人VE-cadherin基因的慢病毒栽体pLB-VEC,并可在Sup-B15白血病细胞株获得有效的表达.
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RNA干扰血管内皮钙黏蛋白表达对Ph+急性淋巴细胞白血病细胞株Sup-B15甲磺酸伊马替尼敏感性的影响
目的 探讨下调Ph+急性淋巴细胞白血病细胞血管内皮钙黏蛋白(CD144)表达对甲磺酸伊马替尼敏感性的影响及可能的机制.方法 通过慢病毒载体介导的RNA干扰(RNAi)沉默急性淋巴细胞白血病株Sup-B15细胞的CD144表达,建立CD144表达稳定下调的细胞株Sup-B15/shVEC.用CCK-8法检测甲磺酸伊马替尼对细胞增殖的影响；用Annexin V/7-AAD标记,流式细胞术检测细胞凋亡；用流式细胞术检测CD34+ CD38-细胞比例变化；荧光定量PCR检测细胞ALDH1 mRNA水平；Western blot法检测细胞CD144、CD133、Bcr-abl、β-catenin表达水平.结果 不同浓度甲磺酸伊马替尼对Sup-B15、Sup-B15/shVEC细胞均有增殖抑制作用,其半数抑制浓度(IC50值)分别为25.1、18.7μmol/L,两组细胞相比差异有统计学意义(P＜0.05).20 μmol/L甲磺酸伊马替尼作用48 h,Sup-B15及Sup-B15/shVEC细胞凋亡率分别为(3.03±0.72)％、(13.52±2.06)％,两组细胞相比差异有统计学意义(P＜0.05).流式细胞术检测结果显示Sup-B 15细胞CD34+ CD38-细胞率明显高于Sup-B15/shVEC细胞[(2.39±0.28)％对(0.96±0.07)％],两组相比差异有统计学意义(P＜0.05).Sup-B15/shVEC细胞与Sup-B15细胞相比,ALDH1转录水平明显下降(0.043 ±0.008对0.016 ±0.003),CD133蛋白、β-catenin总蛋白及核蛋白表达水平也明显下降,而bcr-abl融合蛋白表达水平无明显变化.结论 Sup-B15细胞CD144表达稳定下调后其对甲磺酸伊马替尼敏感性明显增高,该作用可能是通过降低β-catenin蛋白稳定性、减少β-catenin蛋白核转位实现的.
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雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病细胞SUP-B15的增殖、凋亡与自噬的影响
目的 探讨雷帕霉素(RAPA)对人急性淋巴细胞白血病SUP - B15细胞的增殖、自噬与凋亡的影响. 方法 常规方法复苏、传代培养SUP - B15细胞,设置空白对照组(正常培养)、雷帕霉素处理组.处理24、48、72 h后收集细胞,采用MTT比色法检测细胞的活性和增殖能力；采用Annexin V- FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；吖啶橙单染及透射电镜观察细胞自噬现象. 结果 MTT检测结果显示,RAPA对SUP - B15细胞增殖有较强抑制作用(IC50=18.174 nmol/L),且抑制作用随药物剂量增加和作用时间延长而增强；流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示,不同浓度RAPA作用可诱导SUP - B15细胞凋亡,作用48、72 h细胞凋亡较24 h时明显；RAPA作用48 h时的细胞凋亡随药物浓度增大而增多,72 h时高剂量药物(50、100 nmol/L)引起的细胞凋亡较低剂量药物(10、20 nmol/L)少；吖啶橙单染荧光显微镜观察显示,与空白对照组相比,雷帕霉素处理组细胞胞质中出现较多红色斑点的酸性膜泡(即自噬小体),且随药物浓度增大红色斑点增多；透射电镜观察结果显示,雷帕霉素处理组细胞胞质内可见较多自噬小体和自噬溶酶体,线粒体内嵴明显紊乱,细胞核不规则,染色质边缘化. 结论 雷帕霉素对SUP - B15细胞生长有较强的抑制作用；雷帕霉素可诱导SUP- B15细胞发生自噬和凋亡,且自噬的发生先于凋亡出现,一定强度的自噬活性可诱导细胞凋亡增加.
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布罗莫结构域4抑制剂JQ1对Ph阳性急性淋巴细胞白血病细胞增殖的抑制作用和机制研究
目的 观察布罗莫结构域4(brd4)抑制剂JQ1对Ph阳性急性淋巴细胞白血病(Ph+ALL)细胞株SUP-B15的增殖抑制、凋亡作用及对brd4及其下游基因myc、p53表达的影响,探讨其是否对bcr-abl有逆转作用.方法 采用不同浓度的JQ1处理SUP-B15细胞.四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖抑制率;AnnexinV-FITC/PI荧光染色流式细胞术检测细胞凋亡率;实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测bcr-abl、brd4 、myc 、p53的mRNA表达.结果 不同浓度的JQ1均能抑制SUP-B15细胞的增殖,诱导细胞发生凋亡,凋亡率较对照组明显增高,并呈时间-剂量依赖性,作用72 h半数抑制浓度为1.0 μmol/L.同时JQ1可以使bcr-abl、 brd4、 myc的mRNA水平下降,而使p53 mRNA的水平升高.结论 brd4抑制剂JQ1可通过下调brd4的表达,影响其下游基因myc及p53的表达,同时逆转bcr-abl表达,达到抑制Ph+ ALL细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用.
