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人血小板表面CD36糖蛋白检测方法的建立及初步应用
个体血小板表面CD36抗原缺乏在随机输注时有产生抗-CD36免疫反应的风险,是血小板输注无效的原因之一.本研究应用流式细胞术检测杭州地区单采血小板供者的血小板表面CD36抗原表达情况,并分析个体血小板上CD36缺失表型的频率.留取献血者新鲜抗凝血样,经离心获取富血小板血浆,洗涤并调整血小板计数至1×106.采用CD36-FITC、CI41-PE单克隆抗体和血小板孵育反应,然后用流式细胞仪检测和分析血小板表面糖蛋白CD36抗原表达情况.对于血小板表面CD36抗原阴性的标本,进一步筛查其单核细胞表面CD36的表达情况.结果表明:192例无偿献血者筛查出7例血小板表面CD36抗原阴性,CD36缺失型频率为3.6％,均为Ⅱ型缺失.人群中个体CD36抗原表达强度存在差异,参照CD36几何平均荧光强度数值大小,59例为低表达,126例为高表达.结论:人群中存在CD36Ⅱ型缺失表型,这些数据将为研究CD36抗原分布提供参考,有助于解决血小板输注无效问题.
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南宁地区血小板输注无效患者血小板同种抗体检测及特异性分析
目的 分析血小板输注无效(PTR)患者血小板同种抗体的特异性,以便更好的为临床服务.方法 检测并鉴定72例PTR患者血小板同种抗体的特异性;采用流式细胞术(FCM)对其中4例患者进行血小板、单核细胞膜上的CD36抗原检测;基因测序法对上述4例患者进行CD36抗原缺失分型.结果 72例PTR患者中有22例产生血小板同种抗体,其中18例为抗HLA抗体,3例为抗CD36抗体,1例为抗CD36及抗HLA抗体并存;4例含抗CD36抗体的患者经证实均为Ⅰ型CD36缺失个体,基因检测也证实为CD36基因突变所致的CD36抗原缺失.结论 PTR患者血小板同种抗体以抗HLA多见,其次为抗CD36;应对CD36抗原给予足够重视.
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CD36基因新突变T538C（Trp180Arg）导致的CD36缺失和序列特异性引物PCR的基因分型技术的建立
目的：对广西一位女性个体 CD36缺失的分子基础和特征及其基因分布进行研究。方法采用血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(monoclonal antibody immobilization of platelet antigens assay,MAIPA)和流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测确定广西地区一位汉族女性个体的 CD36表型,应用CD36外显子测序、cDNA 克隆测序对其 CD36缺失发生的分子基础展开研究,构建表达CD36突变基因的细胞株[CD36(MT)细胞株]和表达CD36野生型基因的细胞株[CD36(WT)细胞株],应用 Western印迹检测细胞株 CD36蛋白表达情况。建立序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer,PCR-SSP)检测技术对所发现的突变基因进行进一步检测确认,在1010名随机无血缘关系的中国广西健康人中进行该CD36突变基因的多态性调查。结果本研究对象经 MAIPA 和FCM 表型检测结果为Ⅱ型 CD36缺失,CD36外显子测序发现其具有 T538C(Trp180Arg)突变杂合子,该突变点位于CD36第6外显子,克隆测序发现其CD36 cDNA 538位点 T 被 C 所替代,该突变可导致 CD36成熟蛋白氨基酸序列发生 Trp180Arg 改变。应用所建立的CD36 T538C PCR-SSP 检测结果显示 DNA 分型检测结果与测序结果完全一致；Western 印迹结果显示 CD36在CD36(MT)细胞株上不表达,而在CD36(WT)细胞株上有表达。对1010名中国广西人群进行CD36 T538C 的基因多态性调查发现该CD36538T和538C 等位基因频率分别为1.000和0.000,在本次调查人群中未发现具有538C 等位基因的个体。结论发现了一个CD36基因新突变 T538C(Trp180Arg)(GenBank：HM217022.1),并建立了鉴定该基因突变的PCR-SSP 的技术。该基因新突变是中国广西人群中一个罕见型,可导致Ⅱ型 CD36缺失的发生。本研究结果为了解中国地区人群 CD36缺失发生的分子基础和特征以及CD36基因新突变 T538C 的人群调查提供了实验基础。
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孕妇CD36抗原表达筛查及基因测序分析
目的 了解孕妇CD36抗原的表达及其基因型.方法 对在本中心做抗体筛查及血小板抗体检测的200名孕妇,采用流式细胞术检测其血小板及单核细胞上的CD36表达,并对其中血小板或单核细胞上CD36抗原缺失者做基因测序分析.结果 本组孕妇CD36缺失表达率为1.5％(3/200),3例CD36缺失均为Ⅱ型缺失(只有血小板上CD36缺失),未见CD36 Ⅰ型缺失(血小板和单核细胞上CD36都缺失).3例CD36缺失表达者基因测序分析:2例发生CD36基因突变,其突变位点分别是Exon12 A1163T和Exon5 329-330delAC,为常见的基因突变类型;1例为正常CD36基因型.结论 孕妇CD36表达缺失率与中国普通人群相似,缺失者CD36基因发生了基因突变.
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广州地区无偿献血者的CD36缺失频率及其分子基础研究
目的 了解正常无偿献血人群中CD36缺失频率及其分子基础.方法 选取2015年5月-2016年12月选取广州地区1 000名18-55周岁,符合国家献血者健康标准的无偿捐献血小板的健康献血者,采集其外周血3-5mL/人(份),从中分离出血小板和单核细胞,用以做CD36表达水平的流式检测,筛选出CD36缺失者并计算缺失率.提取单核细胞基因组DNA,应用聚合酶链反应-测序分型方法(PCR-SBT)扩增CD36基因的12个编码区序列片段并测序,所得序列与GenBank数据库获取的CD36核酸序列(ACCESSION:NG_008192)做比对分析,确认有无新的基因突变.结果 本组广州地区无偿献血者的CD36缺失率为2.1％(21/1 000),其中CD缺失Ⅰ型占23.81％(5/21)、Ⅱ型占76.19％(16/21).将全部缺失型做测序分析后发现1个新的基因变异型:194-201del TTTGGATC;克隆测序确认该个体(标本)CD36 cDNA从第194位发生TTTGGATC碱基串的缺失;生物信息学分析:该突变型可能导致CD36阅读框发生框移,产生终止密码子,导致编码蛋白提前结束.结论 广州无偿献血人群中存在一定的CD36缺失频率.发现的1例CD36新突变(GenBank:KY972554),其可以促使成熟蛋白氨基酸序列提前结束,可能是引起血小板CD36缺失的原因.
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广西地区汉、壮和瑶族人群CD36缺失结构实验分析和特征研究
目的 建立CD36缺失结构的试验鉴定方法,调查广西地区汉、壮、瑶族人群CD36缺失频率及分布特征.方法 建立血小板流式细胞荧光免疫检测试验(PIFY-FC)对广西地区4 621名无血缘关系的汉、壮、瑶等民族献血者血小板CD36的表达作筛查,以血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(MAIPA)对初筛CD36缺失者复检,以单核细胞流式细胞荧光免疫检测试验(MIFT-FC)检测CD36缺失者的单核细胞CD36的表达,对CD36缺失型个体作缺失型的亚型分型及CD36缺失结构的研究.结果 PIFT-FC和MAIPA筛查出广西汉、壮、瑶族个体CD36的总体缺失率是4.13％(191/4 621),其中汉族人群的缺失率为3.59％(109/3 036)、壮族为5.76％ (80/1389)、瑶族为2.38％ (2/84).对其中117名CD36缺失个体分型检测:Ⅰ型CD36缺失的总体比例为41.03％(48/117),分别是汉族人群39.19％(29/74)、壮族43.90％(18/41)、瑶族50％ (1/2);Ⅱ型CD36缺失的总体比例58.97％(69/117),分别是汉族人群60.81％ (45/74)、壮族56.10％ (23/41)、瑶族50％ (1/2).结论 成功建立PIFT-FC、MAIPA和MIFT-FC试验;广西汉、壮、瑶民族人群间的CD36缺失结构有差异,壮族人群CD36缺失率较高,显示出其民族特征.
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抗-CD36介导血小板输注无效的实验研究——附4例病例报告
目的 对CD36(GPⅣ)同种抗体介导血小板输注无效(PTR)的4例中国广西病例作确诊试验.方法 应用血小板流式细胞荧光免疫检测技术(PIFT-FC)和血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(MAIPA)检测及鉴定4名临床PTR患者血清中的抗-HPA和抗-CD36;以PIFY-FC试验和单核细胞检测流式细胞荧光免疫检测技术(MIFY-FC)检测CD36抗原在患者血小板及单核细胞上的表达情况和作CD36缺失的表现型分型.对患者CD36作基因序列分析和以DNA为基础的PCR-SSP技术鉴定并确认CD36基因突变点,以证实患者CD36的缺失.结果 4名PTR患者体内都含抗-CD36且均为CD36 Ⅰ型缺失者,患者CD36基因检测分别为1例380C＞T、2例329-330 del AC和1例1156C＞T基因突变.结论 确诊4例PTR均为抗-CD36介导;提示在临床遇到PTR病例时,鉴于中国人群有较高的CD36缺失率特征,除考虑HPA及HLA等的免疫因素外,应对抗-CD36介导的同种免疫反应而产生的血小板免疫异常予以重视,并给予针对性的诊断和治疗.
