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Akt的PH结构域与其调节区的结合
目的从人T细胞中克隆Akt的PH结构域及其调节区基因并进行6-his和GST融合表达,研究二者的体外结合情况,为进一步研究Akt的调节区在其分子激活中的作用打下基础. 方法以RT-PCR的方法从人T细胞中扩增目的基因片段,测序证明序列正确. 再将正确的目的基因片段定向克隆到表达载体pRSET-A 和pGEX-4T-1中. 以IPTG诱导,获得Akt的PH结构域及其调节区与6-his和GST的融合表达. 表达的PH结构域融合蛋白经谷胱甘肽耦联的琼脂糖珠纯化,以pull-down法检测该PH结构域与6-his调节区的结合. 结果 Akt的PH结构域和调节区基因序列完全正确,得到与GST和6-his的融合表达,表达产物有较高可溶性. 结论 SDS-PAGE检测到 PH结构域可在体外与调节区特异地结合.
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阿帕替尼联合顺铂对食管癌ECA109细胞抑制作用及机制探讨
目的：探讨阿帕替尼（Apatinib）联合顺铂对食管癌细胞ECA109的抑制作用及其可能的分子机制。方法：对人食管癌细胞株ECA109，单独或联合给药后采用MTT法测定细胞增殖，流式细胞仪测定细胞凋亡，Westernblot观察VEGF、AKT的表达情况。结果：Apatinib及顺铂单药对食管癌细胞株ECA109细胞均有增殖抑制作用，且结果呈时间剂量依赖关系；与对照组相比，Apatinib联合顺铂作用后有协同诱导凋亡作用，两两比较差异均有统计学意义（P＜0．05）；West‐ernblot检测显示对照组与Apatinib单药组，联合用药组与单药组比较，AKT及VEGF表达均显著下调（P＜0．05），而顺铂单药组与对照组相比较，AKT及VEGF表达下调不显著。结论：Apa‐tinib和顺铂联合应用能够在体外协同抑制食管癌ECA109细胞增殖，促进其凋亡，其作用机制可能与下调AKT、VEGF有关。
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雌激素在小鼠表皮发育与人表皮细胞株HaCaT增殖中的作用与机制
目的 观察雌激素在小鼠表皮发育和KC(人表皮细胞株HaCaT)增殖中的作用并探讨其机制. 方法 (1)通过阴道脱落细胞检查法选取5只处于动情期成年C57BL/6小鼠设为动情期组,另将性发育前行卵巢切除的5只成年C57BL/6小鼠设为卵巢切除组.取2组小鼠尾根部全层皮肤,HE染色观测表皮厚度,免疫组织化学染色观察表皮中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞分布并计数.(2)取对数生长期HaCaT细胞,用含体积分数10％ FBS的RPMI 1640培养液培养,按随机数字表法分为阴性对照组、单纯雌二醇组、蛋白激酶B(Akt)抑制剂组、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂组,每组20孔.各组培养液中,阴性对照组加入1 μL二甲基亚砜;单纯雌二醇组加入100 nmol/L17β-雌二醇1 μL;Akt抑制剂组和ERK抑制剂组均加入同前剂量与体积17β-雌二醇,另分别加入10 μmol/L LY294002和30 μmol/L PD98059各1μL.分别于培养0(即刻)、24、48、72 h,每组取5孔细胞,用细胞计数试剂盒8与酶标仪检测细胞增殖活性.(3)取对数生长期HaCaT细胞,同前分组处理,每组3孔.培养72 h,用流式细胞仪检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数(PI).(4)取对数生长期HaCaT细胞,同前分组处理,每组3皿.培养72 h,蛋白质印迹法检测细胞中磷酸化Akt (p-Akt)、磷酸化ERK(p-ERK)和PCNA蛋白水平.细胞实验均重复3次.对数据行t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析、LSD检验. 结果 (1)卵巢切除组小鼠表皮厚度为(33.5 ±3.0) μm,明显薄于动情期组的(51.4±3.1)μm(t=20.7,P＜0.01).2组小鼠PCNA阳性细胞主要集中于表皮基底层;卵巢切除组小鼠表皮中PCNA阳性细胞数为每200倍视野下(37±12)个,明显少于动情期组的每200倍视野下(96±15)个(t=15.3,P＜0.01). (2)培养0～48 h,单纯雌二醇组与阴性对照组细胞增殖活性差异不明显(P值均大于0.05).培养72 h,与阴性对照组比较,单纯雌二醇组细胞增殖活性明显增高(P＜0.01);Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞增殖活性均明显低于前2组(P值均小于0.01).(3)与阴性对照组的(51.6±1.1)％比较,单纯雌二醇组细胞PI明显升高[(58.5±0.8)％,P ＜0.05];Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞PI分别为(34.9±0.8)％、(48.2±0.4)％,均明显低于前2组(P值均小于0.01).(4)与阴性对照组的0.566±0.034比较,单纯雌二醇组细胞p-Akt蛋白水平明显升高(1.048±0.077,P＜0.01);Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞p-Akt蛋白水平分别为0.682±0.095、0.672 ±0.019,明显低于单纯雌二醇组(P值均小于0.01).与阴性对照组的0.469±0.013比较,单纯雌二醇组、Akt抑制剂组、ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平均明显升高(1.064±0.089、1.010 ±0.038、0.778±0.065,P值均小于0.01).与单纯雌二醇组比较,ERK抑制剂组细胞p-ERK蛋白水平明显降低(P＜0.01).与阴性对照组的0.386±0.053比较,单纯雌二醇组细胞的PCNA蛋白水平明显升高(0.743±0.043,P＜0.01);Akt抑制剂组和ERK抑制剂组细胞PCNA蛋白水平分别为0.264±0.019、0.223±0.065,明显低于前2组(P值均小于0.01). 结论 雌激素缺乏时,小鼠表皮发育能力减弱.雌激素(17β-雌二醇)可通过激活ERK/Akt信号通路上调PCNA表达,以促进HaCaT细胞的增殖.
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磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路在电烧伤大鼠血清诱导单核-内皮细胞黏附中的作用
目的 观察磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3 K/Akt)通路在电烧伤大鼠血清诱导的单核细胞中的变化,探讨其在单核细胞与血管内皮细胞黏附中的作用. 方法 取64只清洁级SD大鼠制作电烧伤模型,制备电烧伤大鼠血清;取24只大鼠不作处理,制备正常大鼠血清.(1)常规培养人单核细胞株THP-1细胞,按照随机数字表法将对数生长期细胞分为正常血清组(将细胞重新悬浮于含体积分数20％正常大鼠血清的RPMI 1640培养液中)和烧伤血清组(将细胞重新悬浮于含体积分数20％电烧伤大鼠血清的RPMI 1640培养液中),每组设6个复孔.正常血清组于培养24 h,烧伤血清组于培养3、6、24 h,观察THP-1细胞形态,双抗体夹心ELISA法测定2组细胞上清液中TNF-α含量.2组均于培养3、6、24 h收集细胞,蛋白质印迹法检测Akt活化状态.(2)另取THP-1细胞按照随机数字表法分为4组:正常血清组、烧伤血清组,2组各自培养方法同前;正常血清+阻断剂组、烧伤血清+阻断剂组,在正常血清组、烧伤血清组的培养液中加入渥曼青霉素100 nmol/L,余培养方法同前.每组设6个复孔.取培养3、6h的THP-1细胞,加入单层人血管内皮细胞株EA.hy926细胞,行单核-内皮细胞黏附检测.对数据行单因素方差分析、LSD-￡检验. 结果 (1)正常血清组培养24 h,THP-1细胞呈悬浮生长、形态一致.烧伤血清组培养3h,细胞膜完整,细胞形态不规则;培养6h细胞大小不一,细胞膜与细胞质膨胀;培养24 h细胞膜破裂,细胞死亡.正常血清组培养24 h和烧伤血清组培养3、6、24 h,THP-1细胞上清液中TNF-α含量分别为(38.5±1.4)、(75.1±1.5)、(91.5±1.8)、(117.0±1.4)pg/mL,总体比较差异明显(F=1 415.306,P＜0.01).烧伤血清组培养3、6、24 h THP-1细胞上清液中TNF-α含量均明显高于正常血清组培养24 h(￡值分别为29.614、42.852、63.485,P值均小于0.01).烧伤血清组培养3、6、24 h,THP-1细胞中磷酸化蛋白激酶B/Akt比值分别是正常血清组培养同时相点的2.66、3.69、1.17倍.(2)正常血清组、正常血清+阻断剂组、烧伤血清组、烧伤血清+阻断剂组培养3、6h,每100倍视野下黏附EA.hy926细胞的THP-1细胞数量分别为(231 ±45)、(280 ±47)、(703±169)、(335±85)个,(219±49)、(235±21)、(562±123)、(226±29)个,总体比较均差异明显(F值分别为25.630、18.975,P值均小于0.01).与正常血清组比较,烧伤血清组黏附EA.hy926细胞的THP-1细胞数在培养3、6h均明显增多(￡值分别为6.189、6.601,P值均小于0.01);烧伤血清+阻断剂组黏附EA.hy926细胞的THP-1细胞数在培养3、6h较烧伤血清组均明显减少(t值分别为6.821、6.465,P值均小于0.01). 结论 电烧伤大鼠血清可诱导单核细胞分泌TNF-α,促进单核-内皮细胞黏附.而阻断PI3K/Akt信号通路,可有效抑制单核-内皮细胞的黏附.
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p38丝裂原活化蛋白激酶在烧伤大鼠急性肺损伤中的作用机制
目的研究p38 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在严重烧伤大鼠肺部促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)产生及肺血管内皮细胞损伤中的作用和相关机制. 方法健康成年雄性SD大鼠48只,随机分为假烫(A)组、烫伤对照(B)组和烫伤+p38 MAPK抑制剂SB203580(C)组,每组各16只.观察烫伤(以下称烧伤)24 h后大鼠血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α和IL-1β含量、血浆和肺脏微血管von Willebrand因子(vWF)含量、肺脏激活蛋白1(AP-1)活性等指标的改变. 结果 B组大鼠烧伤后24 h血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量明显增高,血浆vWF含量为(194.2±28.3)%,显著高于A组的(93.2±14.3)%(P<0.01);肺脏微血管vWF含量的积分值为1.1±0.3,显著低于A组的3.3±0.4(P<0.01);其肺脏AP-1活性上升.C组血清和BALF中TNF-α和IL-1β含量、血浆及肺脏微血管vWF含量、肺脏AP-1的活性较B组变化幅度明显偏小. 结论 p38 MAPK活化后,通过活化转录因子AP-1,介导了严重烧伤后肺脏促炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的产生和肺血管内皮细胞的损伤.
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Tyrphostin AG1478对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析
目的:观察Tyrphostin AG1478[4-(3-氯苯胺基)-6,7-二甲氧喹唑啉]对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制.方法:在体外等摩尔数混合重组蛋白激酶CK2 α和β亚基构成CK2全酶,在不同条件下测定CK2的活性.CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP或[γ-32P]GTP的32P放射活度来检测.结果:重组人CK2是一种Ca2+、[KG*2]cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶,与天然CK2的性质一致.AG1478对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用,IC50为25.9 μmol/L,抑制作用接近于已知的CK2抑制剂N-(2-氨乙基)-5-氯萘-1-硫胺(A3),稍小于5,6-二氯-1-β-呋喃糖苯并咪唑(DRB).AG1478对重组人CK2的动力学研究表明:它与GTP和酪蛋白均呈竞争性抑制作用,是一种双底物抑制剂.结论:AG1478不仅是高效特异的表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶的抑制剂,而且也是一种新型有效的蛋白激酶CK2抑制剂.重组人蛋白激酶CK2可作为一种较为简便的筛选和开发有效CK2抑制剂的分子靶点.
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去甲肾上腺素引起C6胶质瘤细胞中钙的动员
目的:研究去甲肾上腺素引起大鼠C6神经胶质瘤细胞中钙离子浓度([Ca2+]i)增加的机理.方法:以荧光染料fura-2为指示剂,采用双波长荧光比值成像的方法测定细胞中钙离子浓度.结果:通过激活细胞上的α1肾上腺素能受体,去甲肾上腺素剂量依赖地使C6细胞中钙离子浓度增加.这种反应不依赖细胞外钙,且不受百日咳毒素(PTX)处理的影响.将细胞与磷酯酶C(PLC)抑制剂U73122或内质网Ca2+-ATP酶抑制剂thapsigargin预孵育,去甲肾上腺素引起的胞内钙反应则消失;蛋白激酶C激动剂佛波醇酯(PMA)预处理细胞可以使去甲肾上腺素引起的胞内钙离子浓度升高幅度降低,而佛波醇酯的效应能够被蛋白激酶C抑制剂Ro31-8220或GF-109203X完全阻断.但是,改变胞内蛋白激酶A活性的药物对去甲肾上腺素的作用没有影响.结论:通过激活胞内的磷酯酶C,去甲肾上腺素使C6细胞的胞内钙库释放钙离子.去甲肾上腺素引起的细胞内钙离子浓度增加受蛋白激酶C的负性调节.
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P物质增强大鼠鞘内注射D-丝氨酸诱发的热痛过敏
目的：研究脊髓伤害性信息传递中P物质(SP)与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体甘氨酸位点激动剂D-丝氨酸(D-serine)之间的功能联系.方法：在浅麻大鼠，采用行为学方法，测定甩尾反射潜伏期(TFL)并结合鞘内给药途径观察药物作用.结果：鞘内注射D-serine 1000 nmol后1.5分钟，TFL明显缩短：在注射D-serine 10 nmol前6分钟鞘内施加SP0.05 nmol，明显增强D-serine 10 nmol引起的TFL缩短效应；选择性NMDA受体甘氨酸位点拮抗剂7-氯犬尿酸l pmol及非选择性PKC抑制剂H-7 10μmol均可阻断这种增强作用.结论：SP可使D-丝氨酸诱发的热痛过敏明显加强，NMDA受体甘氨酸位点及胞内蛋白激酶系统参与了脊髓SP与NMDA受体的相互作用.
