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人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异研究
目的:观察人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2/DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异,分析耐药细胞的特点.方法:比较两者在光镜下的形态、生长特点及体外克隆形成率的差异;流式细胞术分析两者细胞周期分布的变化、多药耐药蛋白P-170及ABCG2表达差异;采用MTF法分析耐药谱;动物实验观察两者成瘤差异.结果:光镜下CNE2/DDP细胞呈圆形,CNE2细胞呈多边形;CNE2/DDP生长相对缓慢;CNE2/DDP、CNE2细胞群体倍增时间分别为29.46 h、21.03 h;CNE2/DDP、CNE2细胞Go/G1期分别为(65.77±0.81)%、(44.9±2.21)%,S期分别为(23.63±0.42)%、(39.67±1.27)%,G2/M分别为(10.93±0.25)%、(13.23±0.31)%,两者相比差异均有显著性统计学意义(P＜0.01).CNE2/DDP、CNE2细胞的P-170和ABCG2表达率分别为(75.93±0.86)%、(2.83±0.40)%和(43.37±0.42)%、(4.07±0.59)%,两者差异有显著性统计学意义(P＜0.01).MTI"法耐药谱分析表明,CNE2/DDP细胞成瘤前、后对DDP及5-氟尿嘧啶长春新碱(VCR)的耐药指数差异均无统计学意义.动物实验表明,1×106个CNE2/DDP、CNE2细胞皮下接种BALB/c裸鼠均成瘤,CNE2组肿瘤生长迅速.结论:CNE2/DDP细胞株具有多药耐药的特点,可用于耐药鼻咽癌的研究.
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地方株HPV16E7基因疫苗诱发的小鼠免疫反应
目的:评价地方株HPV16E7基因疫苗诱导的免疫反应.方法:从先期构建的地方株HPV16E7基因重组质粒pGEM-T-E7经限制性核酸内切酶酶切,获得E7基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建地方株pcDNA-E7基因疫苗,转染CHO细胞,通过IFA试验验证E7蛋白的表达.用pcDNA-E7肌注方法免疫6周龄BALB/c小鼠,同时设pcDNA空载体为阴性对照,于第1天、第15天和第43天共免疫3次,用IFA和MTT法分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答.结果:pcDNA-E7免疫小鼠后能检测出特异的抗体,而原载体免疫后不能产生特异抗体;但2组刺激淋巴细胞增殖的能力差异不显著.结论:地方株HPV16E7基因疫苗可诱导产生小鼠免疫反应.
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表达sFlt-1的小鼠骨髓间充质干细胞介导的抗肿瘤作用研究
目的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓中的一种具有多向分化潜能和很强增殖能力的细胞.经静脉输注的MSCs能特异性地聚集于新生组织,如伤口和肿瘤等,本实验将MSCs作为基因治疗靶向载体,研究其在肿瘤组织内的抗血管作用.方法从雄性小鼠股骨骨髓中分离和培养MSCs,用流式细胞仪检测CD34、CD29、CD44的表达.再用sFlt-1(VEGF-R1)重组腺病毒感染后,给荷瘤小鼠静脉注射.结果间充质干细胞聚集在肿瘤内表达sFlt-1,使得肿瘤血管生成受抑制、肿瘤细胞凋亡增加、肺转移灶减小、生存时间延长.结论本研究表明,MSCs作为基因的运载工具在抗肿瘤领域可能有一定的应用价值.
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自体肿瘤瘤苗对荷瘤鼠Th1、Th2型细胞因子及细胞毒作用的影响
目的研究经处理的H22肝癌细胞肿瘤瘤苗作为全细胞瘤苗对H22荷瘤小鼠体内Th1/Th2细胞比例和细胞因子的影响以及CTL的杀伤活性.方法用加重组白细胞介素2、重组粒细胞单核细胞集落刺激因子及福氏不完全佐剂制成疫苗,建立荷瘤小鼠模型,用51Cr释放法测定瘤苗免疫组、荷瘤组、正常组小鼠脾细胞对亲本H22肝癌细胞的杀伤活性;流式细胞仪检测单个核细胞中的Th1和Th2细胞,并取血检测血清中IL-10、IFN-γ水平.结果效靶比为200:1时,免疫小鼠脾细胞体外杀伤亲本H22肝癌细胞的杀伤率为38.3%,显著高于荷瘤组的13.6%,正常组的7.5%,以及对S180细胞的9.1%(P均＜0.05).瘤苗免疫组Th1细胞及Th1/Th2细胞的比值显著升高(P＜0.01),血清IFN-γ较对照组明显升高(P＜0.01);血清IL-10较对照组明显降低(P＜0.01).结论肿瘤细胞加小剂量IL-2和GM-CSF及佐剂组成的肿瘤细胞瘤苗可激发特异性细胞介导的免疫反应,改善抗肿瘤免疫反应.
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解脲脲原体血清1型与8型对小鼠生殖道的致病性研究
目的 探讨相同条件下,解脲脲原体血清1型(Up1)和8型(Uu8)在BALB/c小鼠生殖道感染模型中的致病性.方法 48只BALB/c小鼠随机分为空白对照组、雌激素组、Up1感染组、Uu8感染组,每组12只.分别接种无菌液体培养基、Up1、Uu8标准菌液.接种后第3、7、14、21天,每组随机取3只小鼠,采集阴道灌洗液后处死,取阴道、子宫标本固定后,HE染色镜检.阴道灌洗液用于培养和肿瘤坏死因子(TNF)-α检测.结果 接种后空白组和雌激素组均无解脲脲原体生长,TNF-α为(4.17±0.85) pg/ml.两个感染组各时间点小鼠阴道冲洗液经培养均为阳性,随着时间延长,测定颜色改变单位逐渐下降.TNF-α在感染后第14天达峰值,分别为(14.93±1.11) pg/ml和(27.04±24.26) pg/ml.组织病理结果显示,Up1和Uu8感染后均可导致急慢性炎症反应,以子宫病变为主,Up1可导致宫腔粘连.结论 BALB/c小鼠下生殖道感染Up1和Uu8后,主要导致宫颈炎,两组致病性未见明显差异.Up1可能与宫腔粘连有关.
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昆明山海棠抗接触变应性光皮炎的研究
目的探讨昆明山海棠抗光变态反应的药效学和药理学.方法以氯丙嗪为光敏剂,在长波紫外线(UVA)的作用下建立起BALB/c小鼠的光变态反应动物模型,灌胃给药,测定小鼠耳部的肿胀程度差、重量差及真皮内浸润的单一核细胞数来判断各组药物的药效学;采用免疫组化测定小鼠皮损处角质形成细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的细胞间黏附分子1(ICAM-1)的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清中干扰素-γ(IFN-y)水平,以阐明昆明山海棠的作用.结果昆明山海棠合剂组的左耳激发前后的厚度差、激发后左右耳的厚度差及组织块的重量差、局部浸润的单一核细胞均小于生理盐水对照(P＜0.01),且小于昆明山海棠单剂组(P＜0.05);昆明山海棠合剂组的皮损中ICAM-1和血清IFN-γ明显低于生理盐水对照组(P＜0.05).结论昆明山海棠合剂组有显著的抗光变态反应作用,其作用比昆明山海棠单剂强,作用机制可能是抑制淋巴细胞IFN-γ的分泌和表皮真皮内ICAM-1的表达,从而减少局部淋巴细胞的浸润,减轻变态反应.
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小鼠膜性肾小球肾炎的形态学计量研究
目的 通过光镜、电镜定量研究分析小鼠膜性肾小球肾炎(MGN)的病理变化.方法 制备小鼠MGN模型,对模型小鼠肾小球进行光镜、电镜形态学观察,并予定量分析.结果 光镜、电镜观察均显示病理组具有典型的MGN病变.病理组基底膜(GBM)厚度分别为0.273nm,对照组为0.1354nm,病理组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).病理组肾小球的平均直径(D),平均周长(B),平均体积(V),平均截面积(A),以及体密度(Vv),面密度(Sv)均大于对照组(P <0.05或P<0.01).数密度(Nv)与比表面(δ)则相反,对照组大于病理组(P<0.01).结论 光镜、电镜定量研究较为客观地反映肾小球肾炎小鼠肾小球的病变程度,为肾小球肾炎发病机理研究及临床治疗提供有价值的参考.
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RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 Mrna
目的建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1(ET-1)mRNA的方法.方法采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法并对实验条件进行优化.建立稳定的检测体系后,对胎鼠大脑皮质ET-1 mRNA进行检测,并以RT-PCR后产物的OD值来反映起初ET-1 mRNA的模板相对含量.结果在一定Taq DNA酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下,ET-1 mRNA经RT-PCR扩增后产物的OD值与ET-1 mRNA模板量成正比.结论优化条件后的RT-PCR是检测ET-1 mRNA的一种敏感、简便、特异、可靠的方法.
关键词： 内皮缩血管肽-1/分析 大脑皮质 聚合酶链反应 小鼠 近交BALB/C -
马齿苋合剂治疗实验性皮肤缺失性创伤的效果观察
目的：考查马齿苋合剂治疗模式动物皮肤缺失性创伤的效果。方法采收培育的荷兰马齿苋鲜草，经粗磨过滤方法制备马齿苋有效成分混合制剂，配以细叶杜香、波斯菊、蜂蜜等中药成分，配以相应的赋形剂，制成外用中药合剂。选取纯白家兔20只和 Balb ／c 小鼠30只，分别随机分组，设马齿苋合剂组、云南白药（阳性对照）组和丁二醇阴性对照组，于背部以外科手术法制造皮肤缺损性创口，施药（施药剂量：家兔20 mg／只、小鼠10 mg／只），每天观测治疗效果。结果马齿苋合剂组与云南白药组相比，创伤创缘的向心性聚缩速度平均慢1～2 d，肉芽组织形成及上皮再生情况差异无统计学意义（P ＞0．05），但明显优于阴性对照组（P ＜0．05）。结论马齿苋合剂能明显促进实验动物皮肤缺损性创伤的愈合。
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HCMV感染Balb/c小鼠椎间盘组织变性模型的初步探讨
目的 建立HCMV感染Balb/c小鼠椎间盘组织模型,从免疫学、基因表达、组织学等方面来探讨HCMV感染致椎间盘组织变性的可能的机制.方法 (1)随机选取6～8周SPF级Balb/c小鼠84只,建立5个不同感染量HCMV AD169株感染Balb/c小鼠模型雌雄各6只为感染组(A组),同时设立病毒灭活组(B组)和细胞对照组(C组)雌雄各6只;(2)间接ELISA法检测小鼠血清中的IgG、IgM抗体水平,取各组小鼠椎间盘组织进行病毒分离,采用PCR和RT-PCR分别检测HCMV UL83基因和UL54基因转录产物;(3)取各组小鼠椎间盘组织行病理学观察.结果 A组和B组小鼠IgG抗体均为阳性,C组为阴性,小鼠IgM抗体仅A组中2×109 PFU·L-1和2×108 PFU·L-1感染组雌性小鼠为阳性,OD值的组间差异有统计学意义(P<0.05);上述两感染组小鼠病毒分离、PCR及RT-PCR均为阳性,病理学观察示小鼠椎间盘组织出现明显的病理变化;雄性小鼠、其余A组、B组和C组均无明显变化.结论 HCMV AD169株能够感染Balb/c小鼠椎间盘,感染与否跟病毒的感染量有关;HCMV活动性感染与椎间盘变性有相关性.该模型对椎间盘变性的分子水平研究有显著的优势,为椎间盘变性动物模型的建立提供了新的思路和平台.
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小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及抗CT-26肿瘤细胞的研究
目的:研究小鼠骨髓树突状细胞的诱导培养及其抗肿瘤特性.方法:用重组的鼠粒-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)及白细胞介素4(IL-4)从小鼠骨髓干细胞中诱导培养树突状细胞(DC),用流式细胞仪检测DC表型.肿瘤细胞CT-26冻融液负载DC后,治疗荷瘤BALB/c小鼠,测定DC抑瘤、消瘤作用及小鼠的生存期变化.结果:诱导的DC形态典型,表面高表达CD80、CD86、I-Ad等免疫分子.抗原负载的DC能明显抑制早期肿瘤的生长,治疗组与非治疗组生存期差异有统计学意义.结论:树突状细胞早期应用具有明显抗CT-26肿瘤细胞作用,可延长荷瘤小鼠的生存期.
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病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡与外周血淋巴细胞凋亡的研究
目的:研究心肌炎小鼠柯萨奇B3(CVB3)病毒性心肌炎模型外周血淋巴细胞凋亡与心肌细胞凋亡的关系.方法:采用Annexin V/PI双参数法在流式细胞仪上定量检测CVB3心肌炎小鼠外周血淋巴细胞凋亡及心肌细胞凋亡百分率.结果:CVB3感染所致心肌炎小鼠外周血淋巴细胞凋亡以及心肌细胞凋亡均显著高于正常对照小鼠(P＜0.001),且两者呈显著正相关(r=0.80,P＜0.01);外周血淋巴细胞及心肌细胞凋亡百分率与心肌病理积分亦呈明显正相关(r=0.72,P＜0.01;r=0.85,P＜0.01).结论:病毒性心肌炎外周血淋巴细胞凋亡可以反映心肌细胞凋亡情况,而且两者均与心肌炎病理损害程度密切相关.
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重组质粒pcDNA3.1(-)-P6-gBCTL-TBK-1的免疫效果评价
目的 观察以TBK-1为分子佐剂的重组质粒pc(pcDNA3.1-)-P6-gBCTL-TBK-1的免疫效果.方法 将构建的真核表达质粒pc-P6-gBCTL-TBK-1转染HeLa细胞瞬时表达,Western blotting验证融合蛋白的表达.将重组质粒肌内注射免疫接种BALB/c小鼠,分别于第0、2、4周免疫接种3次,第5周采集免疫小鼠的眼眶静脉血,第8周处死小鼠后无菌分离小鼠脾脏.ELISA法检测免疫小鼠血清的特异性抗HSV-2gD-P6抗体滴度、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-6(IL-6)的浓度,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖率,乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活性.结果 以TANK binding kinase-1(TBK-1)为分子佐剂的重组质粒可刺激机体产生特异性的抗HSV-2gD-P6抗体,诱导分泌较高水平的IFN-γ、IL-4和IL-18,并能促进小鼠脾淋巴细胞的增殖和增强CTL活性.结论 构建的HSV-2DNA疫苗pc-P6-gBCTL-TBK-1具有一定的免疫原性,能诱导产生一定强度的细胞免疫和体液免疫,TBK-1具有良好的分子伴侣作用.
关键词： TANK结合激酶-1 DNA疫苗 单纯疱疹病毒2型 小鼠 近交BALB/C -
抗MIF单克隆抗体的制备及其放射性碘标记方法
目的 制备抗小鼠巨噬细胞移动抑制因子(mMIF)单克隆抗体(McAb)对其进行放射性碘标记,为进一步研究MIF在炎症、肿瘤核素显像中的意义奠定基础.方法 异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)诱导pEQ30-mMIF/M15工程茵表达重组mMIF蛋白;采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,蛋白质印迹技术(Western blotting)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行特异性鉴定,巨噬细胞移动抑制试验(MMI)鉴定生物学活性.采用二氯二苯基甘脲(Iodogen)法,用Na125 I标记抗mMIF单克隆抗体.结果 成功建立3株稳定高效价分泌抗mMIF单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5G2D7,5G2C7,5G2E3.经Western blotting、ELISA和MMI鉴定证明抗mMIF单克隆抗体具有良好的抗原特异性和生物学活性;125 I-抗mMIF单克隆抗体的标记率为90.40%,放射化学纯度98.36%,放射性比活度为21.48MBq/μg.结论 成功制备抗栅单克隆抗体和放射性碘标记抗mMIF单克隆抗体,为深入研究MIF相关性疾病和利用MIF进行临床肿瘤及炎症放射免疫显像提供了实验基础.
关键词： 巨噬细胞移动抑制因子 单克隆抗体 放射性同位素 小鼠 近交BALB/C -
胚胎干细胞诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构研究
我们对体外诱导生成的胰岛素分泌细胞的超微结构进行了研究,并将其与在体胰岛素分泌细胞的结构加以比较,以期为诱导生成胰岛素分泌细胞的成功提供证据.
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BALB/c小鼠渍疡性结肠炎远段结肠Cajal间质细胞分布变化
目的 建立BALB/c小鼠急、慢性溃疡性结肠炎(UC)动物模型,观察UC小鼠远段结肠组织中Cajal间质细胞(ICC)分布的变化,探讨ICC在UC肠功能紊乱发病中的作用.方法 将30只BALB/c小鼠随机分为健康对照组、急性和慢性UC组,每组各10只.通过饮用50g/L葡聚糖硫酸钠(DSS)方法建立BALB/c小鼠急、慢性UC动物模型,对照组仅饮用蒸馏水.应用免疫荧光、激光共聚焦荧光定量等技术检测ICC在UC小鼠远段结肠组织内分布的变化.结果 1.健康对照组远段结肠组织ICC主要分布在黏膜下丛(IC-SM)和肌间丛(IC-MY),IC-MY在切面上几乎呈现连续性分布,相互连接形成网络状结构;2.急性UC组远段结肠组织内ICC的分布较健康对照和慢性UC组明显减少(Pa＜0.001),IC-MY的网络状结构完全破坏,残存ICC形态也出现异常;3.慢性UC组远段结肠组织ICC的分布较健康对照组减少(P＜0.05),但较急性UC组显著增加(P＜0.001),其形态接近正常,但IC-MY的连续性分布不明显,未能形成正常的网络状结构.结论 UC小鼠远段结肠组织内ICC分布减少,形态异常,推测与UC小鼠肠功能紊乱有一定相关性.
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BALB/c小鼠溃疡性结肠炎远段结肠Cajal间质细胞超微结构变化
目的 观察急慢性溃疡性结肠炎(UC)小鼠远段结肠组织Cajal间质细胞(ICC)超微结构变化,探讨ICC在UC肠功能紊乱发病中的作用.方法 将30只BALB/c小鼠随机分为健康对照组、急性UC和慢性UC组,每组10只.通过饮用50 g/L葡聚糖硫酸钠(DSS)法建立BALB/c小鼠急、慢性UC动物模型,将仅饮用蒸馏水的BALB/c小鼠作为对照组.分别取3组小鼠远段结肠组织标本,固定、脱水、包埋,常规超薄切片,硝酸铅、醋酸铀染色,JEM-2000EX透射电子显微镜观察.采用SPSS 11.6软件进行统计学处理.结果 1.健康对照组BALB/c小鼠远段结肠ICC超微结构主要特点:细胞呈纺锤形,有巨大的卵圆形核及向外伸展的长突起,胞质内有丰富的线粒体、大量光面和粗面内质网;环肌层和纵肌层ICC与肠神经元及平滑肌细胞之间联系密切.2.急性UC组小鼠远段结肠ICC超微结构改变:细胞体积增大;线粒体肿胀、电子密度降低,部分线粒体空泡样变;溶酶体数目增多,出现次级溶酶体;部分ICC胞质内可见大量脂滴;黏膜下层(IC-SM)周围出现大量巨噬细胞.3.慢性UC组小鼠远段结肠ICC超微结构改变:细胞形态基本正常,线粒体形态基本正常或轻度肿胀,溶酶体数目增多,以初级溶酶体为主;IC-SM周围巨噬细胞数目较少.结论 UC小鼠远段结肠组织ICC超微结构发生改变,这些结构改变与其功能改变密切相关,推测与UC小鼠肠功能紊乱有一定相关性.
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天麻素对模拟高原缺氧小鼠的保护作用
目的 采用常压密闭缺氧耐受力实验联合急性减压缺氧耐受力实验,探索天麻素对模拟高原缺氧小鼠的保护作用.方法 100只雄性BalB/c小鼠随机分为两组用于两个实验,每组50只小鼠按照随机数字表法分为5个亚组:空白模型(M)组、红景天阳性对照(RC)组、天麻素低剂量(GAS-L)组、天麻素中剂量(GAS-M)组、天麻素高剂量(GAS-H)组,各10只.每日定时灌胃,连续7d.第七天给药50 min后,分别比较5组小鼠在密闭缺氧环境下的存活时间以及在急性减压条件下的存活率,从动物整体水平上评价天麻素的抗缺氧活性.结果 天麻素3个剂量均可有效延长常压密闭缺氧环境下小鼠的存活时间(P＜0.01),降低小鼠暴露于急性减压缺氧条件中的死亡率.但天麻素低、中、高剂量组间无显著量效关系.结论 天麻素能够对模拟高原缺氧小鼠起到一定保护作用.
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用登革Ⅲ型病毒免疫小鼠后特异性IgG抗体的动态变化
目的:以登革Ⅲ型病毒(DV3)免疫成年BALB/C小鼠,观察血液中特异性IgG抗体的动态变化.方法:以不同剂量DV3经皮下注射和肌肉注射接种成年BALB/C小鼠,用间接免疫荧光法检测不同时间机体末梢血中特异性IgG抗体及其水平.结果:不同剂量DV3免疫BALB/C小鼠均可诱导体液免疫应答,特异性IgG抗体于免疫后第8～12天开始产生,于第15～18天达高峰(1∶80),继而下降.特异性IgG类抗体可维持47 d以上,其中以1 000TCID50DV3免疫BALB/C小鼠早产生特异性抗体且水平高.结论:经皮下和肌肉注射DV3,可诱导BALB/C小鼠产生特异性IgG类抗体.
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体外分离培养Balb/c小鼠胚胎干细胞向神经细胞定向诱导分化
目的: 探讨体外分离培养、诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为神经细胞的高效方法. 方法: 自孕3.5 d的Balb/c小鼠获得附植前的早期胚胎,机械剥离法去除胚胎的滋养层细胞获取内细胞团(ICM)分别在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层上和明胶包被的培养板中培养获得类ESCs克隆. 进行碱性磷酸酶染色,SSEA-1细胞免疫化学鉴定及体内分化实验鉴定. 模拟体内神经系统发育过程采用序贯诱导方法定向诱导ESCs分化为神经细胞,进行分化后细胞的免疫细胞化学鉴定. 结果: 所分离得到的细胞碱性磷酸酶染色阳性,SSEA-1表达阳性,体内分化实验证实具有多向分化潜能. 符合ESCs的一般特性. 经过序贯诱导方法可以高效诱导ESCs分化为神经细胞. 结论: 体外分离得到的Balb/c小鼠的ESCs经过模拟体内神经系统发育过程经过序贯诱导方法可以高效的诱导为神经细胞,且所获得的神经元比例高.
