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端粒重复因子2与p53的体外结合
目的通过分析端粒主要结合蛋白端粒重复因子2 (TRF2)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法 4种不同的p53-谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白和GST经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-SepharoseTM4B纯化,其中的人重组p53包括野生型(1～393)、C端缺失体p53 N5(2～293)、N端缺失体p53 N5(95～393)、第175位氨基酸突变体(R→H).将各纯化蛋白和人乳腺癌细胞MCF-7的细胞蛋白进行体外结合反应(pull down),Western blot 检测反应物中p53和TRF2的结合.结果纯化的GST和p53-GST融合蛋白纯度均在90%以上,且相对分子质量与预计的完全一致.TRF2的Western blot显示:野生型p53和p53-R175H均能沉淀MCF-7中的TRF2,且结合力相似,而单独的GST则无沉淀TRF2的作用.与野生型p53和p53 R175H相比,p53 2C与TRF2的结合力相对增加,p53 N5与TRF2的结合力相对大大减弱.结论 p53和TRF2可以进行直接而特异的体外结合,且其结合部位在p53 的C端(293～393). p53和TRF2 的C端依赖性结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.
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纤连蛋白结合蛋白新功能肽段FnBPA-D1c/D2n的初步研究
金黄色葡萄球菌是引起化脓性感染的主要病原菌,而且能引起多种其他疾病,纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FnBP)是介导金葡菌侵袭宿主细胞的关键表面蛋白[1].本研究选定金葡菌FnBP蛋白D结构域的一个非完整重复序列--D1区域的C端与D2区域的N端(FnBPA-D1c/D2n)为研究对象,观察其与纤连蛋白(Fn)的结合活性以及其对金葡菌侵袭细胞的抑制作用,为进一步探讨FlnBP功能区奠定基础.
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人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点
目的:检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性,探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点,从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索.方法:采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT 基因第2内含子多态性VNTR片段,克隆并鉴定,以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验,以确定该片段是否存在蛋白结合位点.结果和结论:hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点,该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物,蛋白结合的关键位点处于42 bp重复单元C端的典型E-box基序(CACGTG),但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元.此外,利用第6内含子内上游的VNTR (VNTR6-1st)的重复单元做为探针,结果发现该38 bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合,从而提示了不同VNTR序列功能的多样性.
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PCBP1的新伴侣蛋白分子的研究
Objective: PCBP1 is a family member of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) that belong to RNA-binding proteins and bear three KH domains. The protein plays a pivotal role in post-transcriptional regulation for RNA metabolism and RNA function in gene expression. We hy-pothesized and were going to identify that the regulatory function of PCBP1 is performed through different complexes of proteins that include PCBP1. Methods: To test our hypothesis, approaches of protein wal-king with a yeast two-hybrid system (Y2H), pulling down in yeasts, co-immunoprecipitation and immu-nofluorescent microscopy assay were employed in this study. The PCBP1 was used as the initial "walker" to search for its interaction partner(s). Results: Candidate proteins including MYL6, PECAM1, CSH1,RAB7, p57KIP2, ACTG1, RBMS1 and PSG4-1ike were identified with selection mediums and preceding methods. Conclusion: With these candidate protein molecules, some protein complexes associating with PCBP1 are proposed, which may help in a better understanding of physiological functions of PCBP1 and proved evidence that PCBP1 is involved in variant biological pathways.
关键词： Poly(C)结合蛋白质1 酵母菌 杂交 遗传 蛋白质结合 -
利用谷胱甘肽S转移酶表达标签捕获系统性红斑狼疮相关基因IFIT1的相互作用蛋白质
目的试图运用蛋白组学的策略研究系统性红斑狼疮(SLE)相关的干扰素诱导蛋白IFIT1的蛋白质相互作用,以揭示其可能的功能.方法应用荧光实时定量PCR进一步验证SLE患者外周血白细胞转录水平IFIT1基因的表达;应用分子克隆技术在大肠杆菌克隆并表达谷胱甘肽S转移酶(GST)-IFIT1融合蛋白;利用GST表达标签,以GST-IFIT1为饵蛋白捕获SLE外周血白细胞蛋白裂解物中与IFIT1存在相互作用的蛋白质,MALDI-TOF-MS肽指纹图谱进行蛋白质鉴定.结果荧光实时定量PCR证实IFIT1基因确在SLE(40例)较正常对照(29例)表达上调(P＜0.001).克隆表达了GST-IFIT1融合蛋白,并捕获到一个与IFIT1存在相互作用的蛋白质,经肽指纹图谱初步鉴定为Rho/Rac鸟嘌呤核苷交换因子.结论IFIT1是SLE新的相关基因.运用蛋白组学的策略研究IFIT1蛋白质水平的相互作用显示,IFIT1与Rho/Rac鸟嘌呤核苷交换因子存在相互作用,IFIT1可能通过该途径影响Rho蛋白的活化,参与SLE的发病.
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脂多糖结合蛋白与冠心病的相关性研究
目的 探讨脂多糖结合蛋白与冠心病的相关性.方法 行择期冠状动脉造影术的患者176例,于术前采血测定血清脂多糖结合蛋白和高敏C反应蛋白的含量.结果 与56例非冠心病组相比,120例冠心病组的脂多糖结合蛋白含量明显升高,12.61 mg/L vs 8.37 mg/L(P＜0.001);总体上随狭窄＞50%病变血管支数增加逐步升高(P＜0.05),且随斑块不稳定性升高而升高(P＜0.01).血清脂多糖结合蛋白含量与冠状动脉病变的Gensini评分显著相关(rs=0.321,P＜0.001),多元逐步回归分析显示血清脂多糖结合蛋白含量是冠状动脉病变严重程度的独立风险因子(β-0.180,P＜0.05).结论 脂多糖结合蛋白可以作为冠心痛的一种新的血清学标志物,且对血管病变程度及病情有提示意义.
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PRMT7与HSPA5相互作用促进肺癌转移的研究
目的 探究PRMT7在肺癌转移中的功能,并找到调控PRMT7的信号分子.方法 通过免疫蛋白共沉淀法得到一系列与PRMT7相互作用的蛋白,通过蛋白质谱分析,结合生物信息学的方法,筛选具有显著意义的相互作用蛋白,并进行验证.结果 确认了HSPA5等5个候选基因,经过对各种肺癌数据库的分析发现,候选基因的表达水平高于其他基因.结论 PRMT7与HSPA5存在相互作用,此发现有助于阐明PRMT7对肺癌细胞入侵和转移的促进作用.
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肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位喹诺酮耐药决定区变异型与底物分子对接分析
目的 了解2种肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位喹诺酮耐药决定区变异型与各种底物的结合能力.方法 参照野生型作同源建模获得2种肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位变异型(Ⅰ型和FH型)立体结构,ArgusLab 4.1软件中的DOCK模块做DNA旋转酶A亚单位野生型和2种变异型与7种喹诺酮类药物分子对接,计算酶与底物结合自由能值(△G),并计算DNA旋转酶A亚单位氨基酸残基与环丙沙星相互作用原子对数量及距离.结果 肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位变异型Ⅰ型、FH型与吡哌酸、环丙沙星、加替沙星结合自由能值分别为-26.607 50、-29.530 39、-29.493 09 kJ/mol,-26.696 44、-28.972 83、-29.590 50 kJ/mol;野生型分别为-27.188 82、-30.872 00、-30.244 04 kJ/mol,即吡哌酸、环丙沙星、加替沙星与2种变异型结合力下降,呈现耐药.Ⅰ型、FH型与左氧氟沙星结合自由能值为-29.013 81、-29.497 57 kJ/mol,野生型为-28.016 20 kJ/mol.Ⅰ型、FH型与萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星结合自由能值有升有降.DNA旋转酶A亚单位野生型、Ⅰ型、FH型与环丙沙星相互作用形成原子对距离在5×10-10 m以内的分别有16对、2对和4对；形成原子对距离在4×10-10 m以内的只有8对,均为野生型.结论 肺炎克雷伯菌DNA旋转酶A亚单位2种变异型与环丙沙星结合力下降是耐药的形成因素.
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用HPLC法测定人血浆中野黄芩苷的蛋白质结合率
目的:建立人血浆中野黄芩苷的检测方法,测定野黄芩苷的蛋白质结合率.方法:用HPLC法测定血浆和透析液中野黄芩苷的浓度,用平衡透析法测定血浆蛋白质结合率,蛋白质结合率按B%=[(ct-cf)/ct]×100%计算.结果:正常人血浆中野黄芩苷浓度在0.05、0.5、5 μg/L时的蛋白质结合率分别为(79.9±1.71)%、(82.0±1.02)%和(68.9±1.21)%.结论:野黄芩苷在0.05和0.5 μg/L时,属于高度结合,但随着浓度升高,蛋白质结合率降低.
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超高效液相色谱-串联质谱法测定人血浆中卡巴他赛与血浆蛋白的结合率
目的 建立并应用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中卡巴他赛与血浆蛋白的结合率.方法 以拉洛他赛为内标,样品经叔丁基甲醚液液萃取,采用ACQUITY BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相:2 mmol·L-1醋酸铵水溶液-乙腈;流速:0.2 mL·min-1;进样量:5 μL;柱温:35℃;采用ESI正离子源,定量分析离子反应分别为m/z 836.36→m/z 555.26(卡巴他赛)和m/z 832.25→m/z 551.08(内标拉洛他赛).结合平衡透析法,测定了卡巴他赛的人血浆蛋白结合率.结果 卡巴他赛浓度在5～1 000ng·mL-1范围内线性关系良好,定量下限为5 ng·mL-1,日内和日间精密度均小于15.0％,提取回收率为70.0％ ～ 91.4％,基质效应为87.4％～ 100.9％,可用于卡巴他赛的血浆蛋白结合率研究.卡巴他赛在低、中、高三个浓度下的人血浆蛋白结合率为(87.8±4.0)％、(76.4±0.8)％和(73.5±6.4)％.结论 本方法简单、快速、灵敏,能满足分析要求.卡巴他赛与人血浆蛋白结合率较高,与血浆蛋白结合能力在考察的浓度范围内无浓度依赖性.
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白藜芦醇衍生物RT-B与大鼠血浆蛋白结合率的测定
目的 建立测定白藜芦醇衍生物RT-B与大鼠血浆蛋白结合率的方法.方法 采用平衡透析法对RT-B与大鼠血浆蛋白结合率进行HPLC测定.结果 低、中、高3种浓度下,RT-B的血浆蛋白结合率分别为(79.2±s 0.7)%,(80.1±0.9)%和(80.2±0.9)%.结论 本方法灵敏度高,重现性好,操作简单,能满足分析要求.RT-B与大鼠血浆蛋白的结合率较高.
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药物的人体内肝脏代谢清除率的体外预测
在药物开发初期,就将药动学性质不佳的新化学实体剔除出去具有十分重要的意义.通过人体内肝脏代谢清除率的体外预测,可以淘汰那些可能从体内迅速被清除的化合物,并可以建立口服生物利用度的预测模型,以指导临床剂量的确定.本文以肝微粒体和肝细胞为模型,阐述药物的人体内肝脏代谢清除率的体外预测过程,并讨论药物的蛋白结合对预测的影响.
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从分子极性表面积预测头孢菌素类药物的血浆蛋白结合率
目的:采用分子结构参数预测头孢菌素类药物的血浆蛋白结合率.方法:用半经验自洽场分子轨道AM1法得到药物分子的优化几何构型,用Monte Carlo法计算分子极性表面积,相关分析采用逐步多元回归分析法.结果:头孢菌素类药物的血浆蛋白结合率(fb)与分子量(MW)和氢键给体表面积(SH)具有良好的相关性,回归方程式为:fb=0.5057+2.861×10-3MW-0.1572SH+4.714×10-3SH2(n=22,r=0.9042).结论:头孢菌素类药物的血浆蛋白结合率不仅与药物的脂溶性,而且还与形成氢键的能力密切相关.从药物的分子量和极性表面积可以预测头孢菌素类药物的血浆蛋白结合率.
