汉坦病毒部分S基因在毕赤酵母中的分泌表达

目的 构建并表达汉坦病毒(HV)Z10株(HV-Z10)S基因蛋白编码区前300 bp核苷酸序列,研究该基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达及其产物的生物活性.方法 根据HV-Z10 S基因前300 bp(S300)的核苷酸序列,按照编码氨基酸的密码子转换成酵母偏爱的形式,设计合成8条引物,通过连续PCR,获得人工合成Z10株S基因前300 bp的基因序列SP300,经测序,SP300与S300的核苷酸相似性为76.2%,但编码的氨基酸序列完全一致.将SP300克隆到酵母穿梭载体pPICZaA,构建含α-factor分沁信号肽的重组表达载体pPICZaA-SP300.将pPICZaA-SP300、pPICZaA-S300化学法转化酵母GS115菌株,筛选重组转化子.结果 重组了SP300与S300的酵母转化子经甲醇诱导,表达出重组蛋白rNP300及rN300,SDS-PAGE显示相对分子质量为12×10~3左右.经ELISA检测及Westem Blot分析,表达产物能与抗汉坦病毒抗体起免疫反应.结论 SP300和S300基因在毕赤酵母中获得分泌表达,使用酵母偏爱密码子的SP300基因在毕赤酵母中的表达量与S300的表达量基本一致,表达量在诱导24 h后高.

汉坦病毒感染的量子点标记免疫检测研究

目的 应用量子点荧光标记技术和间接免疫法,建立一种新的汉坦病毒(HV)感染的免疫检测技术.方法 采用碳二亚胺交联法,在水溶性量子点表面修饰protein G和羊抗人IgG.以HV抗原片为固相载体,QDs-PG-IgG复合物为标记二抗,检测待检血清中的HV特异性抗体,并对检测条件进行优化.结果 量子点与羊抗人IgG的佳偶联条件:反应时间2h、pH 6.0、羊抗人IgG浓度20 μg/ml.检测体系的佳反应条件:量子点标记二抗的适工作浓度为1:200,HV感染阳性血清检测的大稀释度为1:1280.结论 成功建立了简便、快速的HV感染的量子点标记免疫检测方法,该方法具有良好的灵敏度和特异性,抗荧光猝灭性强,为进一步实现HV抗体的单分子定量检测奠定基础.

肾综合征出血热并发血糖升高6例临床观察

流行性出血热6例误诊原因分析

流行性出血热是由汉坦病毒引起的全身毛细血管损伤性疾病,可导致机体发生多脏器损伤,主要临床表现:发热、出血、休克及急性肾功能衰竭,其早期病情复杂,个体差异大.典型病例有发热期、低血压期、少尿期、多尿期、恢复期5期经过.非典型病例往往出现越期现象,重者还出现发热、休克、少尿2期或3期重叠,临床表现复杂多样,误诊机会较多.现就我院2000年1月至2003年6月误诊的6例病例讨论如下.

肾综合征出血热合并肝损害

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒(HV)所引起的全身毛细血管损伤性疾病,可导致机体发生多脏器损伤,临床表现复杂多样,误诊机会较多,有时处理颇为棘手,预后欠佳.据称HFRS所致多脏器损害的发生率依次为肾、肝、胃肠、心脏、肺、脑、胰腺和生殖道等.我们重点对HFRS与肝损害的关系,和临床有关问题进行简要的探讨.

肾综合征出血热的诊断与鉴别诊断

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒(Hanta virus,HV)引起的,以全身毛细血管损伤为病理基础的自然疫源性疾病,它可引起多种脏器损伤及功能障碍,临床表现复杂多样,既可具有一些共同的临床表现,也可以某一器官或系统损害为突出表现而就诊.关键问题在于早期确定诊断,进而采取有效的对策.

肾综合征出血热疫苗及治疗研究进展

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属中的病原体引起的一种病情重、病死率高的自然疫源性急性传染病.

哈尔滨地区肾综合征出血热患者临床特征及感染的汉坦病毒血清型分析

目的 研究哈尔滨地区肾综合征出血热患者的流行病学、临床特征及感染的汉坦病毒的血清型.方法 对哈尔滨地区87例肾综合征出血热患者的流行病学资料、临床表现、实验室检查、转归等进行回顾性分析,并对发病5 d内患者感染的汉坦病毒血清型进行分析.结果 87例患者中74.7%为农民,14.9%为林业工人,6.9%为学生、干部职员,3.4%为居民;农村56例,林区13例,郊区9例,城市9例.临床表现发热87例(100%),头痛44例(50.6%),腰痛35例(40.2%),眼眶痛17例(19.5%),恶心呕吐79例(90.8%),皮下出血点、淤斑29例(33.3%),少尿52例(59.8%),黑便35例(40.2%),腹痛26例(29.9%),腹胀61例(70.1%),抽搐2例(2.3%),呼吸困难4例(4.6%).三红征40例(46.0%),肾区叩痛52例(59.7%),球结膜水肿47例(54.0%).实验室检查肝功能异常70例(80.5%);心肌酶学升高80例(92.0%);血糖异常53例(60.7%).患者感染的汉坦病毒血清型,汉滩病毒占34.8%,汉城病毒占65.2%.结论 哈尔滨地区肾综合征出血热的流行病学和临床特征的改变可能与汉坦病毒血清型的变化有关.

重组汉坦病毒核蛋白的原核表达及纯化

目的 原核表达重组汉滩型病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白(recombinant HTNV nuclearprotein,rHTNNP)和重组汉城型病毒(Seoul virus,SEOV)核蛋白(recombinant SEOV nuclear protein,rSEONP),并进行纯化.方法 从HTNV PS-6株和SEOV L-99株灭活病毒液中提取总RNA,依据病毒S片段多变区基因序列两端保守序列设计引物,用逆转录PCR法扩增此S基因片段,构建原核表达质粒pET-Trx-his-HTNNP和pET-Trx-his-SEONP,并在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经凝胶电泳初步鉴定和镍柱亲和层析纯化后,用双向免疫扩散试验检测其抗原特异性.结果 重组表达质粒经菌落PCR分析和测序证明构建正确.表达的rHTNNP和rSEONP相对分子质量约为26 000,表达量分别约占菌体总蛋白的30％和20％,主要以可溶性形式表达,且纯度可达约70％.双向免疫扩散试验证实,这2种重组蛋白具有较好的抗原性.结论 成功构建了表达rHTNNP和rSEONP的原核表达质粒,并获得了较高纯度的rHTNNP和rSEONP,为汉坦病毒型别鉴定试剂盒的开发奠定了基础.

汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因的DNA免疫

目的将编码汉坦病毒浙37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒免疫小鼠,观察其能否诱导体液免疫应答.方法重组质粒pcDNA3.1-G1、pcDNA3.1-G2以不同方式免疫BALB/C小鼠,用免疫荧光测定(IFA)法检测血特异性抗体,用半微量直接免疫酶斑减少中和试验检测血中和抗体.经肌内注射途径免疫15只BALB/C小鼠,3组小鼠分别注射100μg pcDNA3.1、pcDNA3.1-G1、pcDNA3.1-G2;每只小鼠免疫3次,初次免疫后4周,加强2次,间隔3周.经基因枪免疫9只BALB/C小鼠,3组小鼠分别注射1.5μg pcDNA3.1、pcDNA3.1-G1、pcDNA3.1-G2;每只小鼠免疫2次,初次免疫后4周,加强1次.结果 1.经肌内注射免疫时,产生特异性抗体的小鼠个数分别是:pcDNA3.1-G1组为5只中3只,pcDNA3.1-G2组为5只中2只;荧光抗体滴度1:20～1:80;产生中和抗体的小鼠个数分别是:pcDNA3.1-G1组为5只中1只,pcDNA3.1-G2组为5只中2只;中和抗体滴度1:10～1:20.2.经基因枪免疫时,实验组小鼠都产生了特异性抗体和中和抗体.荧光抗体滴度1:20～1:320,中和抗体滴度≥1:10.结论重组质粒pcDNA3.1-G1、pcDNA3.1-G2能诱导小鼠产生有效的体液免疫应答.

汉坦病毒四川分离毒株SN7——HTN的新亚型

目的对四川省社鼠分离株SN7进行生物学和分子生物学鉴定.方法应用单克隆抗体抗原性分析和空斑减少中和试验(PRNT)和PCR分型方法分析、克隆测定了SN7株的M和S片段基因,并同汉坦病毒其他病毒株进行比较. 结果单克隆抗体和PRNT、PCR分型方法均无法对SN7株定性,序列分析表明SN7毒株与现有的HTN型毒株M片段同源性为80.2%～87.1%,差异高达12.9%～19.8%;S片段为76.6%～92.0%,差异也高达8%～23.4%,而与SEO毒株M片段的同源性为70.0%～71.6%,S片段为71.0%～72.2 %, SN7株病毒可以定型为HTN型病毒. 结论 SN7株为HTN型的新亚型毒株.

深圳市肾综合征出血热疫源地宿主动物汉坦病毒分离株的基因分型

目的 对深圳市肾综合征出血热(HFRS)疫源地进行宿主动物汉坦病毒分离,研究分离株的基因分型.方法 采用幼龄长爪沙鼠接种和Vero-E6细胞培养的方法进行汉坦病毒分离,用直接免疫荧光实验进行鉴定.应用型特异性引物进行反转录一套式PCR分别扩增M片段G1、G2区、S片段,并测定核苷酸序列,进行同源性比对和进化树分析.结果 从深圳市褐家鼠肺中成功分离到2株汉坦病毒,命名为SZ2082和SZ2083,经反转录一套式PCR扩增并进行序列测定显示为第2型汉城病毒型(SEOV).通过对3个基因片段序列比较分析发现,SZ2082和SZ2083部分M和S片段核苷酸序列完全一致.M片段G1、G2区核苷酸序列与SEOV国际代表株80-39的同源性分别为96.7%、95.0%,与第1型汉滩病毒型(HTNV)型国际代表株76-118的同源性仅为75.9%、70.3%.S片段与SEOV80-39和HTNV76-118比较,核苷酸同源性分别为95.7%和69.7%,与M片段的结果相似.通过M片段G2区的分析发现,SZ2082与BjFT01、Beijing-Rn、Guang199、HN71-L处于同一分支,同源性为99.0%～99.7%.结论 在深圳市分离到汉坦病毒,通过鉴定其属于汉城型病毒S2亚型.

针对汉坦病毒S基因反义寡核苷酸抗病毒效应的研究

目的:研究反义寡核苷酸(asON)体外抗汉坦病毒(HV)的效应.方法:设计合成了分别针对HV S基因片段5′端手柄状结构区的asON1和针对mRNA翻译起始区的asON2,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测asON作用后HV感染细胞培养上清中HV核蛋白(NP)的表达水平,免疫荧光试验(IFA)检测asON作用后感染细胞膜上NP的表达水平,空斑减少中和试验(PRNT)测定asON作用和HV感染细胞培养上清液中病毒滴度.结果:asON可抑制NP的合成以及病毒活性.结论:asON具有一定的抗HV作用,有可能作为一种治疗人HV感染的新途径.

山东地区汉坦病毒重要基因序列进化关系的研究

目的:研究山东地区汉坦病毒的基因型分布.方法:应用RT-PCR法和直接核酸测序法,对来源于山东省11个肾综合征出血热流行地区的患者中获得的31份汉坦病毒部分M基因片段进行了扩增和测序.结果:核苷酸序列的同源性及系统发生树分析表明,山东地区SEO型汉坦病毒至少存在4个不同亚型,HTN型汉坦病毒至少发现有4个分支,不同HTN型汉坦病毒亚型间的核苷酸序列的差异达13.0%～22.7%,而不同SEO型汉坦病毒分支间相对保守,差异仅5.0%～7.7%.结论:山东地区存在汉坦病毒的不同的基因亚型,这一发现将促进汉坦病毒流行规律、致病性和疫苗的研究.