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siRNA沉默Drp1对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬和凋亡的影响
目的 探究siRNA沉默动力相关蛋白1(Drp1)后对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬以及细胞凋亡的影响.方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,用1μm、5μm、10μm、20μm鱼藤酮进行处理24 h、48 h,MTT法检测细胞抑制情况.将细胞分为鱼藤酮佳浓度处理组(20μm鱼藤酮处理,损伤组)、阴性转染组(损伤组基础上转染Drp1阴性序列)、Drp1siRNA处理组(损伤组基础上转染Drp1 siRNA)、Drp1抑制剂组(损伤组基础上添加Mdivi-1试剂)、自噬促进剂组(损伤组基础上添加雷帕霉素).观察各组线粒体自噬情况、细胞线粒体功能相关蛋白(Mfn2、Drp1、NRF1)、自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)、凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况和细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞抑制率均升高,随着浓度以及培养时间的增加,细胞抑制率逐渐增加(P<0.05).损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组LC3II定位在细胞线粒体,且细胞线粒体结构受损,外周出现自噬双层膜.与Drp1 siRNA转染组、Drp1抑制剂组相比,损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组Drp1、LC3II、Beclin-1、Bax蛋白表达和细胞凋亡率升高,Mfn2、NRF1、P62、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05).结论 Drp1参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬,沉默Drp1用.可降低鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬以及细胞凋亡,具有保护作.
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杨梅素通过促进DRP1依赖性线粒体分裂诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡
目的:观察杨梅素与mdivi-1分别或联合作用于人卵巢癌SKOV3细胞后细胞凋亡和线粒体分裂情况,探讨杨梅素诱导SKOV3细胞凋亡的机制.方法:体外培养SKOV3细胞,随机分为对照组、mdivi-1组、杨梅素组和联合给药组,mdivi-1组以50 μmol·L-1 mdivi-1作用1h后更换普通细胞培养液继续培养23 h,杨梅素组以50 g·L-1杨梅素作用24 h,联合给药组以50 μmol·L-1 mdivi-1作用1h后更换含50g· L-1杨梅素的细胞培养液继续培养23 h.MTT法检测各组细胞存活率;Muse(R)凋亡检测试剂盒检测各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blotting)观察细胞色素C(Cyt C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(easpase3)、动力相关蛋白1(DRP1)和分裂蛋白1(FIS1)表达水平;MitoTracker(R) Red荧光探针特异性标记线粒体观察各组细胞线粒体分裂情况.结果:与对照组比较,杨梅素组细胞存活率明显降低(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合给药组细胞存活率明显升高(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞凋亡率升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞中Cyt C和easpase3蛋白表达水平明显升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组Cyt C和caspase3蛋白表达水平明显降低(P＜0.05).与对照组比较,杨梅素组细胞线粒体分裂程度增强;与杨梅素组比较,联合用药组线粒体分裂程度下降.与对照组比较,杨梅素组细胞中DRP1和FIS1蛋白表达水平升高(P＜0.05);与杨梅素组比较,联合用药组DRP1和FIS1蛋白表达水平降低(P＜0.05).结论:杨梅素可通过促进DRP1依赖性线粒体分裂诱导人卵巢癌SKOV3细胞凋亡.
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线粒体分裂对胰岛β细胞功能的影响
目的 探讨线粒体分裂对胰岛β细胞功能的影响.方法 通过可诱导表达野生型动力相关蛋白1(Drp-1 WT)基因和突变型Drp-1(Drp-1K38A)基因的大鼠INS-1 β细胞,分析不同葡萄糖条件下,线粒体分裂对胰岛β细胞功能的影响.结果 在高糖条件下,强力霉素诱导后的Drp-1WT细胞线粒体分裂过程增强,网络状结构部分断裂,多呈点状结构,细胞胰岛素分泌功能降低(P<0.01),线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞内ATP含量减少(P<0.05),细胞色素C表达增加,而在Drp-1K38A细胞中,上述变化明显减轻.结论 线粒体分裂增强可抑制胰岛β细胞功能.
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戴蒙开颗粒对阿尔茨海默病小鼠脑组织线粒体动力学的影响
目的:探讨戴蒙开颗粒对阿尔茨海默病小鼠脑组织线粒体动力学的影响.方法:30只APP/PS1小鼠随机分为模型组、戴蒙开颗粒治疗组(中药组),并以15只同月龄同性别的C57BL/6J野生型小鼠作为空白组.中药组给予剂量2.0 g·kg-1·d-i的戴蒙开颗粒0.2 ml灌胃,模型组和空白组给予等体积的0.9％NaC1溶液灌胃;均灌胃12周.干预结束后,取脑组织分离线粒体,运用Western Blot法检测小鼠脑组织线粒体及去线粒体胞浆动力相关蛋白1(dynamin-related protein1,Drp1)、分裂蛋白1(fission1,Fis1)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy-1,Opa1)和小鼠脑组织NIX蛋白的含量;Elisa法检测小鼠脑组织Bax、Bcl-2蛋白表达.结果:与空白组比较,模型组小鼠脑组织线粒体及去线粒体胞浆Drp1、Fis1、NIX、Bax蛋白含量均明显升高(P＜0.01),Opa1、Bcl-2含量则明显降低(P＜0.01);与模型组比较,中药组小鼠脑组织线粒体及去线粒体胞浆Drp1、Fis1、NIX、Bax含量明显降低(P＜0.05,P＜0.01),Opa1、Bcl-2含量明显升高(P＜0.01).结论:戴蒙开颗粒可改善阿尔茨海默病小鼠脑内线粒体分裂融合异常.
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线粒体分裂和融合相关蛋白质的研究进展
线粒体是多细胞生物的一个重要组成部分, 它对细胞以及机体的健康具有十分重要的作用.线粒体可以产生能量, 介导钙和活性氧信号转导, 甚至调控细胞凋亡.近年来研究显示, 线粒体在细胞中处于不断分裂与融合的状态, 并且可以在细胞内重新分布, 线粒体的这种特性统称为线粒体动力学.线粒体动力学对维持线粒体各种功能极其重要, 成为了近年来的研究热点.本文重点综述了哺乳动物细胞内线粒体分裂和融合相关蛋白质的结构以及生物学功能.
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动力相关蛋白1的小泛素化相关修饰物化修饰在脑缺血/再灌注损伤中的作用
背景 近年研究发现动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)介导的线粒体分裂在脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CI/RI)中发挥了重要作用,Drp1的小泛素化相关修饰物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)化修饰能影响自身生物学效应.目的 阐述Drp1的SUMO化修饰在CI/RI中的作用.内容 分别描述Drp1蛋白、SUMO蛋白、SUMO相关酶(SUMO化酶/去SUMO化酶)及SUMO化修饰对Drp1生物学效应的影响.趋向 研究SUMO化修饰影响Drp1的生物学效应的机制,为减轻或治疗CI/RI找到新的靶点或提供新的思路.
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动力相关蛋白1迁移在脓毒症心肌细胞炎症反应中的作用
目的:探索动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,DRP1)在脓毒症心肌细胞炎症反应中的作用.方法:取12只3-4月龄SD大鼠,随机均分为3组.模型组以3 g/kg剂量于腹腔注射大鼠盲肠内容物(180 mg/mL)制备脓毒症模型;对照组大鼠腹腔注射生理盐水;抑制剂组大鼠先腹腔注射线粒体分裂抑制剂-1(Mdivi-1,25 mg/kg)预处理1h,再腹腔注射盲肠内容物.6h后观察大鼠心肌间质白细胞浸润程度并测定心肌组织髓过氧化物酶(MPO)活性.同时收集对照组、模型组大鼠血浆用于刺激乳鼠心肌细胞.蛋白质印迹法检测脓毒症血浆刺激后的乳鼠心肌细胞DRP1在丝氨酸637(S637)位点的磷酸化程度及其向线粒体的迁移.RT-PCR和ELISA法分别检测脂多糖诱导的CXC趋化因子(LPS-induced CXC chemokine,UX)以及角质细胞源性趋化因子(keratinocyte-derived chemokine,KC)mRNA及蛋白的表达.结果:与对照组比较,脓毒症大鼠心肌白细胞浸润明显增加、MPO活性显著升高(P均＜0.05);Mdivi-1抑制剂预处理可显著减少心肌白细胞浸润并降低MPO活性.脓毒症血浆刺激心肌细胞引起DRP1于S637位点去磷酸化并由胞质迁移至线粒体,同时趋化因子LIX和KC表达、释放增加.Mdivi-1(10 μmol/L)抑制DRP1可减少脓毒症血浆刺激的心肌细胞趋化因子LIX和KC的表达及释放.结论:脓毒症时DRP1由胞质迁移至线粒体在心肌细胞炎症反应中起着关键作用.
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线粒体分裂对醛固酮肾损伤小鼠足细胞的影响
目的：探讨线粒体分裂‐动力相关蛋白1（Drp1）及其抑制剂Mdivi‐1在醛固酮肾损伤小鼠足细胞中的作用及可能机制。方法20只小鼠随机均分为假手术组（A组）、M divi‐1处理组（B组）、醛固酮损伤组（C组）和醛固酮损伤＋ Mdivi‐1处理组（D组）。采用Western blot检测Drp1、细胞色素C（Cyt C）及足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin、podocin的表达，免疫荧光技术检测肾小球足细胞中Drp1定位，酶标仪检测半胱天冬氨酸蛋白酶3（Caspase‐3）、Caspase‐9的活性。结果与A组相比， C组Drp1表达及Caspase‐3、Caspase‐9活性增加，Cyt C向细胞质释放增多，nephrin、podocin表达降低（P＜0．01）；而D组Mdivi‐1处理后能逆转C组各观察指标的变化过程（P＜0．01）。结论 Drp1可能通过线粒体凋亡途径减轻醛固酮诱导的足细胞损伤。
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带有caspase富集功能域的凋亡抑制因子对急性病毒性心肌炎小鼠心肌的保护作用
目的 研究急性病毒性心肌炎(AVMC)小鼠的带有caspase富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)的表达及对心肌的保护.方法 将60只成功建立AVMC模型的小鼠随机分为ARC反义寡核苷酸组(A组)、ARC错义寡核苷酸组(B组)和生理盐水对照组(C组),每组20只.分期分别采集标本测定外周血心肌钙蛋白T(cTnT)、心肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)水平和ARC、动力相关蛋白1(Drp1)表达等数据.结果 造模后第7、14、21天,3组外周血cTnT、cTnI、CK、CK-MB水平差异有统计学意义(P<0.05),C组与B组相近(P>0.05),但均低于A组(P<0.05).造模后第7天,3组ARC与Drp1蛋白表达水平差异有统计学意义(P<0.05),C组ARC表达与B组相近(P>0.05),但均高于A组(P<0.05),C组Drp1蛋白表达与B组相近(P>0.05),但均低于A组(P<0.05);造模后第14、21天3组ARC与Drp1蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05).结论 小鼠发生AVMC后高表达的ARC可抑制心肌细胞凋亡,对心肌组织有保护作用.
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AKAP1在高糖诱导的足细胞线粒体分裂中的作用
目的 研究A激酶锚定蛋白(AKAP1)在高糖诱导足细胞线粒体分裂中的作用及可能的信号转导通路.方法 体外培养条件永生性人足细胞,完全分化并同步化处理后进行后续实验.实验分组:(1)葡萄糖浓度分为5、15、25、35 mmol/L组刺激足细胞48 h;(2)高糖(35 mmol/L)培养基分别刺激足细胞12、24、36、48 h;(3)正常对照组(5 mmol/L葡萄糖)、高渗对照组(30 mmol/L甘露醇+5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(35 mmol/L葡萄糖)、高糖(35 mmol/L葡萄糖)+AKAP1 siRNA组.免疫荧光染色检测足细胞中AKAP1的表达和分布,Western印迹检测足细胞中AKAP1、线粒体动力相关蛋白1(dynamin related protein1,Drp1)、p-Drp1蛋白水平.Mitotracker Red染色观察各组足细胞线粒体形态,对长度、纵横比、形状系数定量分析.流式细胞术评价足细胞凋亡水平.结果 与正常组比较,高糖刺激导致足细胞凋亡增加(P＜0.05),线粒体分裂增加、纵横比及形状系数降低(均P＜ 0.05),AKAP1蛋白表达水平、p-Drp1/Drp1以时间、浓度依赖方式增加(P＜0.05);与高糖组比较,AKAP1 siRNA转染后线粒体分裂减少,线粒体纵横比及形状系数升高(均P＜ 0.05),足细胞凋亡减少;AKAP1蛋白水平及p-Drp1/Drp1下降(P＜0.05);上述各项高渗对照组与正常对照组差异均无统计学意义(均P＞ 0.05).结论 高糖刺激下AKAP1可能通过线粒体Drp1调控足细胞线粒体分裂,导致足细胞损伤.
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动力相关蛋白-1在缺氧/复氧诱导人肾小管上皮细胞焦亡机制中的作用
目的 观察人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤时线粒体动力相关蛋白1 (dynamin-related protein 1,Drp1)、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,Nlrp3)以及炎性因子的表达改变和细胞焦亡情况,探讨Drp1在H/R诱导肾小管上皮细胞焦亡中的作用.方法 HK-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12液培养于37 ℃、5％ CO2和95％O2的恒温培养箱.将细胞分为正常对照组、H/R组、H/R+ Drp1抑制剂(H/R+Mdivi-1)组、H/R+siNlrp3腺病毒(H/R+siNlrp3)组、H/R+空腺病毒(H/R+ Scra)组.检测细胞培养液上清乳酸脱氢酶LDH活性,Western blot检测Drp1、Nlrp3、凋亡相关蛋白-l(caspase-1)、IL-1β表达,2',7 '-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞活性氧(ROS)水平,流式分析仪检测细胞焦亡情况.结果 与正常对照组比较,H/R组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显升高,Drp1、Nlrp3、caspase-1、IL-1β表达增高,细胞焦亡明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与H/R组比较,H/R+Mdivi-1组培养液上清LDH和细胞内ROS水平明显降低,Nlrp3、caspase-1、IL-1 β表达降低,细胞焦亡明显减少,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在H/R条件下,Drp1通过激活Nlrp3炎性体诱导人肾小管上皮细胞焦亡.
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色素上皮衍生因子对缺氧条件下H9C2心肌细胞保护作用
目的 探讨色素上皮衍生因子(PEDF)对H9C2心肌细胞在低氧无血清条件下的保护作用及其可能的机制.方法 体外培养H9C2细胞进行低氧无血清处理,将细胞分为对照组(H9C2)、缺氧组(缺氧+H9C2)、PEDF组(缺氧+H9C2+PEDF)、残粒体分裂抑制剂(Medivi-1)组(缺氧+H9C2+Mdivi-1).TUNEL染色检测H9C2心肌细胞凋亡率;Western blot检测动力相关蛋白1(Drp1)、活化半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspase3)的蛋白水平;电镜及MitoTracker Red检测线粒体形态;采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测线粒体膜电位,MitoSOXTM检测线粒体活性氧簇(ROS)水平.结果 缺氧诱导H9C2细胞线粒体分裂,缺氧组(6 h)与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),PEDF减少缺氧条件下线粒体分裂,PEDF组与缺氧组(6 h)比较差异有统计学意义(P＜0.05),PEDF和Mdivi-1可以减少缺氧条件下(24 h)细胞凋亡,与缺氧组(24 h)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 PEDF通过抑制缺氧条件下H9C2细胞线粒体分裂减少细胞凋亡.
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动力相关蛋白1通过诱导线粒体自噬对高糖导致心肌细胞损伤的影响
目的 明确动力相关蛋白(Drp)1通过诱导线粒体自噬对高糖条件下心肌细胞起保护作用.方法 以Lac Z空病毒(LV-LacZ)或Drp1过表达腺病毒(LV-Drp1)转染大鼠原代心肌细胞24 h,再用含葡萄糖(5.5 mmol/L)的正常培养基(NG)或含葡萄糖(33 mmol/L)的高糖培养基(HG)处理大鼠心肌细胞72 h.实验分组:1:①阴性对照(NG+ LacZ)组;②正常Drp1过表达(NG+ Drp1)组;③高糖阴性对照(HG+LacZ)组;④高糖Drp1过表达(HG+ Drp1)组.采用免疫荧光法检测自噬体数量,用JC-1染色法检测线粒体膜电位水平,采用Westem blot法检测Drp1、Parkin(一种E3泛素化连接酶),微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62蛋白表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡率.结果 与对照组相比,高糖处理组自噬体数量明显减少(P＜0.05),线粒体膜电位显著下降(P＜0.05),线粒体自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Parkin水平下调(P＜0.05),Drp1,P62表达水平显著增高(P＜0.05),心肌细胞凋亡率升高(P＜0.05);与高糖组比较,Drp1过表达组可显著增加自噬体数量(P＜0.05),线粒体膜电位上升(P＜0.05),Drp1,Parkin,LC3-Ⅱ表达水平显著上升(P＜0.05),P62水平显著下降(P＜0.05),心肌细胞凋亡率下降(P＜0.05).结论 高糖可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬水平降低和线粒体功能障碍,是糖尿病心肌病发病机制之一.Drp1通过提高线粒体自噬水平改善线粒体功能,降低高糖条件下心肌细胞凋亡率.
