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β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体体外基因沉默效应研究
目的:探讨β-arrestin2抗基因RNA慢病毒载体在体外工具细胞中的基因沉默效应及其携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.方法:用构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒感染NG108-15细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测β-arrestin2抗基因RNA慢病毒对工具细胞的β-arrestin2 mRNA和蛋白表达的下调作用,以及该病毒所携带的用于活体核磁共振成像监测的铁蛋白报告基因的表达.结果:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒能显著降低工具细胞中β-arrestin2 mRNA和蛋白的表达,与对照组相比实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测的沉默效率分别为79%和82%(P<0.05).感染病毒组的NG108-15细胞的铁蛋白表达量显著升高,是对照组细胞的2.29倍(P<0.05).结论:构建的β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在工具细胞中对β-arrestin2基因具有显著的沉默效应,该病毒携带的铁蛋白报告基因在工具细胞中表达.成功验证了β-arrestin2抗基因RNA慢病毒在体外的基因沉默效应和铁蛋白报告基因的表达,为该病毒的在体研究奠定了基础.
关键词： 基因沉默 抗基因RNA β-arrestin2 慢病毒载体 铁蛋白 -
芬太尼对慢性吗啡耐受大鼠中脑导水管周围灰质μ受体与β-arrestin 2表达的影响
目的 观察芬太尼对慢性吗啡耐受大鼠中脑导水管周围灰质μ受体与β-arrestin2表达的影响.方法 健康成年雄性SD大鼠40只,体重(230±20) g,随机分为5组(n=8):NS组(对照组):皮下注射生理盐水1 ml/kg 2次,间隔30 min;M组(慢性吗啡耐受组):皮下注射吗啡10 mg/kg,30 min后皮下注射生理盐水1 ml/kg;MF1、MF2、MF3组:吗啡用药同M组,注射吗啡30 min后分别皮下注射芬太尼3、6、12 μg /kg.各实验组每日给药2次,连续9 d,给药后进行痛阈测定.断头处死大鼠,取中脑导水管周围灰质组织(PAG),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法 测定μ受体、β-arrestin2的mRNA表达,免疫印迹(Western- blot)方法 测定μ受体、β-arrestin2的蛋白表达.结果 注射吗啡后,M组大鼠痛阈值明显高于NS组(P<0.01),连续给药9天后,痛阈值降至给药前水平.与M组比较,MF2组与MF3组大鼠痛阈值下降趋缓,第7、9天,MF2组与MF3组痛阈值均高于M组(P<0.05或0.01),MF1组差异无统计学意义(P＞0.05).与NS组比较,M组μ受体mRNA及其蛋白表达显著下调(P<0.01);与M组比较,MF2组和MF3组μ受体mRNA及其蛋白表达上调(P<0.05或0.01),MF1组差异无统计学意义(P＞0.05).M组β-arrestin2mRNA及其蛋白表达明显低于NS组(P< 0.01);MF2组和MF3组β-arrestin2 mRNA及其蛋白表达高于M组(P<0.05或0.01),而MF1组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 芬太尼6、12 μg/kg通过上调慢性吗啡耐受大鼠PAG 部位μ受体与β-arrestin2表达,可增强吗啡镇痛作用,部分延缓慢性吗啡耐受产生.
关键词： 吗啡耐受 芬太尼 中脑导水管周围灰质 μ受体 β-arrestin2 -
β-arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的增殖影响
目的：观察外源性β-arrestin2基因对人肺腺癌细胞A549增殖的影响。方法利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3 c．1-β-arrestin2质粒和空载体pcDNA3．1质粒分别导入A549细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆，RT-PCR和Western blotting检测β-arrestin2基因表达的影响。采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法分析转染细胞的增殖情况。结果经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达β-arrestin2基因的A549细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染β-arrestin2基因的细胞生长速度明显减慢（ P ＜0．05）。结论β-arrestin2基因可能通过抑制P65活性而抑制人肺腺癌细胞A549的生长。
关键词： β-arrestin2 肺腺癌 A549细胞 细胞增殖 -
β-Arrestin 2缺失导致的小鼠骨重塑与骨组织GPER1表达下降关联
目的 探讨β-arrestin 2缺失对小鼠骨重塑的影响及其发生机制.方法 采用16、26、30周龄β-arrestin 2敲除雌鼠和野生型雌鼠,通过双能X射线吸收法(DXA)检测其全身骨密度,微CT检测股骨微结构,RT-PCR检测骨形成、骨吸收相关因子和G蛋白耦联雌激素受体1的表达.结果 β-Arrestin 2敲除雌鼠在16周龄已出现全身骨密度降低,16、26、30周分别降低了8.10％、7.53％、8.56％.骨微结构检测显示3个周龄雌鼠骨体积分数均降低(分别为53.3％、49.4％、55.7％),骨小梁数量均减少(分别为53.2％、52.1％、49.3％),与各自的对照组野生型小鼠相比,差异均具有显著性(P＜0.05).相反随着周龄的增长,敲除雌鼠骨小梁模式因子、间距、结构模型指数差异逐渐增大,至30周时与对照野生型小鼠相比差异统计学显著(分别增加了32.0％、54.3％、23.7％,P＜0.05).胫骨RT-PCR检测显示护骨素,破骨细胞分化因子(RANKL)和G蛋白耦联雌激素受体1(GPER1) mRNA表达均降低,与对照组有明显差异(P＜0.05).结论 β-Arrestin 2缺失导致的小鼠骨重塑与GPER1表达相关,提示其可能通过G蛋白耦联雌激素受体信号通路影响骨重塑.
关键词： β-arrestin2 骨密度 骨微结构 护骨素 G蛋白耦联雌激素受体1 -
β-arrestin2在可卡因诱导的奖赏行为中的作用
β-arrestin2是G蛋白偶联受体的负反馈调控蛋白,介导受体的脱敏,此外β-arrestin2还可以通过招募信号分子,介导G蛋白非依赖的信号传导过程.β-arrestin2广泛分布于各重要脑区,参与神经环路的信号传递.本文旨在研究β-arrestin2在可卡因诱导的小鼠奖赏行为中的作用.采用β-arrestin2基因敲除小鼠(Arrb2-/-),检测了β-arrestin2在不同剂量可卡因诱导的条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)形成中的作用,还检测了其在可卡因诱导的自主活动性变化中的作用.结果显示,在中等剂量(20 mg/kg)和高剂量(30 mg/kg)可卡因诱导的CPP实验中,Arrb2-/-小鼠比野生型小鼠(Arrb2+/+)表现出更强的可卡因诱导的位置偏爱,而在低剂量(10 mg/kg)可卡因实验中两者无显著性差异.可卡因诱导的Arrb2-/-小鼠的自主活动性显著低于Arrb2+/+小鼠.以上结果提示,β-arresstin2在可卡因诱导的奖赏行为中起重要作用.
关键词： β-arrestin2 可卡因 条件性位置偏爱 自主活动性 -
LiCl对七氟醚引起的神经细胞凋亡的缓解作用
目的 研究氯化锂(LiCl)对中枢神经系统发育期七氟醚神经毒性的影响,以及β-arrestin2/AKT信号通路在其中所起的作用.方法 对离体培养7d的海马神经细胞及出生后7d的Sprague-Dawley幼鼠进行七氟醚处理(3％,6 h),制备七氟醚神经毒性模型.离体实验中给予LiCl或LiCl+β-arrestin2 siRNA转染处理后,应用流式细胞仪、MTT及Hoechst染色检测细胞凋亡;应用免疫印迹检测total AKT、Phospho-AKT、total GSK3β、Phospho-GSK3β、Bax及Bcl-2的蛋白表达水平;应用条件恐惧实验及Morris水迷宫检测实验动物的情绪及空间学习记忆功能变化.结果 七氟醚处理(3％,6 h)使海马神经细胞凋亡增加,应用LiCl则可明显缓解七氟醚神经毒性.七氟醚处理可降低Phospho-AKT及Bcl-2的蛋白表达,增加Phospho-GSK3β及Bax的蛋白表达;LiCl可增加Phospho-AKT及Bcl-2表达,降低Phospho-GSK3β及Bax表达水平.LiCl的神经保护作用可被转染β-arrestin2 siRNA、SH-5或LY294002所逆转.LiCl明显缓解了中枢神经系统发育期七氟醚处理引起的情绪及空间学习记忆功能异常.结论 LiCl可缓解中枢神经系统七氟醚神经毒性,其机制可能与β-arrestin2依赖的AKT/GSK3β信号通路有关.
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siRNA沉默β-arrestin2促进肝星状细胞凋亡
目的 研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 干扰β-arrestin2表达对大鼠肝星状细胞株(hepatic stellate cell T6,HSC-T6)凋亡的影响.方法 将化学合成的siRNA β-arrestin2 以Lipofectamine 包裹,转染HSC-T6 细胞,设阴性对照和空白对照;采用逆转录-聚合酶链反应和Western blot检测细胞β-arrestin2表达;采用Western blot检测细胞Bcl-2、Bax的表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 转染siRNA的HSC-T6细胞β-arrestin2基因及蛋白表达水平明显下调,β-arrestin2 mRNA水平和蛋白表达水平比对照组分别下调了70%±1.76%和68.43%±2.88%(P<0.01);Bcl-2蛋白被抑制了32.58%±3.46%(P<0.01),而Bax表达增加38.00%±3.72%(P<0.01);转染β-arrestin2 siRNA的HSC-T6细胞凋亡率为37.5%,明显高于正常HSC对照组.结论 siRNA β-arrestin2 能高效抑制HSC-T6 细胞β-arrestin2表达明显减少Bcl-2的表达,增加Bax的表达,从而促进HSC-T6凋亡,具有预防及治疗肝纤维化的潜力.
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TGF-βⅢ型受体介导的信号通路及其在纤维化疾病中的作用
转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在细胞的自我调控包括细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、免疫监督、血管再生等过程中发挥重要作用。TGF-βⅢ型受体（TβRⅢ）是 TGF-β超家族的辅助受体之一，TβRⅢ不仅能介导TGF-β超家族配体依赖的Smad经典通路，还可以介导非Smad依赖的信号通路，参与调控细胞的多种信号通路，在纤维化、肿瘤、心血管系统等疾病中发挥重要作用。该文就TβRⅢ参与的信号通路及其在纤维化疾病中的作用作一综述。
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黄精皂苷对慢性应激抑郁大鼠大脑皮层5-HT1AR-β-arrestin2-akt信号通路的影响
目的 探讨黄精皂苷(SRP)对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响及部分机制.方法 60只 SD大鼠随机均分为正常组、模型组、SRP (400、200、100 mg/kg)组和氟西汀(2 mg/kg)组.采用7种不同应激方法建立大鼠慢性应激抑郁模型,观察大鼠行为学指标变化;免疫组化法测定大脑皮层区5-羟色胺1A受体(5-HT1AR)的表达;Western blot法分析大脑皮层区5-HT1AR、β-arrestin2、akt蛋白表达水平.结果 应激刺激后,与正常组相比,模型组大鼠体重降低、自主活动次数减少,处于抑郁状态.免疫组化法及Western blot法结果显示,与正常组相比,模型组大脑皮层5-HT1AR表达降低,β-arrestin2、akt表达升高 (P<0.05),而SRP组可以逆转这种现象(P<0.05,P<0.01).结论 中药SRP的抗抑郁作用可能与调节5-HT1AR/β-arrestin2/akt信号通路有关.
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β-arrestin2在炎症性肠病中的研究进展
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性非特异性的炎症性疾病,可分为溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD),其发病机制至今尚不十分清楚,但一般认为可能与炎症反应[1]、免疫调节失衡[2]、细胞增殖凋亡等[3]有关.近年发现,β-arrestin2作为细胞内上游信号调节因子,通过G蛋白偶联受体或自身作为支架蛋白在炎症及免疫信号通路、细胞增殖凋亡等方面有重要作用[4].此外,在组织纤维化等方面也存在一定作用[5-6],从而可能参与IBD的发生、发展过程.本文将就β-arrestin2在IBD中的作用作一综述.
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TNBS诱导大鼠实验性结肠炎的致病机制
目的 探讨三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠实验性结肠炎的致病机制.方法 18只雄性SD大鼠随机分为3组,每组6只:正常组、模型组、美沙拉嗪组.除正常对照组未行造模外,其余两组大鼠均采用TNBS造模.模型组不设干预,正常饮食;美沙拉嗪组给予美沙拉嗪混悬液0.42 g/(kg·d)灌胃;治疗15 d后观察大鼠的结肠病理组织学改变,用免疫组化染色法观察大鼠结肠组织IL-17、β2AR、β-arrestin2、NF-κBp65的表达;用Western blot法检测大鼠脾淋巴细胞β2AR,β-arrestin2和NF-κBp65蛋白的表达;用RT-PCR法检测大鼠结肠组织STAT6 mRNA的表达.结果 美沙拉嗪组大鼠的腹泻、黏液脓血便症状得到较快改善,大鼠黏膜组织损伤也明显改善.与正常组相比,模型组大鼠NF-κBp65和STAT6 mRNA表达增多(P＜0.01),β2AR和β-arrestin2的表达减少(P＜0.01);与模型组比较,美沙拉嗪组大鼠脾淋巴细胞NF-κBp65和STAT6 mRNA表达减少(P＜0.01),而β2AR和β-arrestin2的表达增多(P＜0.01).IL-17在正常组和美沙拉嗪组呈低表达,而在模型组呈高表达.结论 IL-17、β2AR、β-arrestin2、NF-κBp65、STAT6在TNBS诱导大鼠实验性结肠炎的致病过程中发挥重要调节作用.
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胎膜早破患者胎膜组织中β-arrestin2和NF-κB p65表达变化的研究
目的:研究胎膜早破(PROM)患者胎膜组织中β-arrestin 2和NF-κκB p65表达变化情况,探讨β-arrestin 2-NF-κB信号通路在PROM发生中的作用.方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和Western blot方法分别检测2015年10月至2016年2月在郑州大学第三附属医院住院分娩的37例正常足月妊娠妇女和35例PROM患者的胎膜组织中β-arrestin2和NF-κκB p65基因及其蛋白质的表达变化情况.结果:与正常对照组比较,PROM组胎膜组织中β-arrestin 2 mRNA及其蛋白质表达均明显下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);而PROM组胎膜组织中NF-κB p65mRNA及其蛋白质表达均明显增高,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:β-arrestin2和NF-κB p65在PROM胎膜组织中表达改变与PROM的发生有一定关系.
关键词： β-arrestin2 NF-κB P65 胎膜早破 -
β-arrestin2通过破坏肠上皮屏障功能而促进小鼠肠炎
目的 观察β-arrestin2对小鼠肠炎进展的影响,并从肠上皮屏障功能方面探讨β-arrestin2作用机制.方法 用葡聚糖硫酸钠(DSS)制备小鼠急性肠炎模型,将实验对象分为3组:野生型对照(WT)组、野生型肠炎(WT+DSS)组和β-arrestin2-/-肠炎(KO+DSS)组.比较β-arrestin2在WT组和WT+DSS组结肠中mRNA和蛋白表达水平;比较WT+DSS组和KO+DSS组的体重下降程度、疾病活动指数、脾脏重量、结肠长度及病理学表现、肠上皮FITC-D渗透率及紧密连接蛋白(occludin,claudin1,ZO-1)表达水平.结果 β-arrestin2在WT+DSS组小鼠结肠中的mRNA和蛋白水平高于WT组;相比于WT+DSS组,KO+DSS组体重下降程度小(P<0.05),疾病活动度轻(P<0.05),脾脏肿大和结肠缩短程度小,病理学评分更低(P=0.002),肠上皮渗透率更低(P=0.009),occludin和claudin1蛋白表达水平更高,ZO-1在两组间无明显差异.结论 β-arrestin2可能通过破坏肠上皮屏障而促进小鼠肠炎.
关键词： β-arrestin2 肠上皮屏障功能 紧密连接 肠炎 炎症性肠病 -
β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的作用
目的 探讨β-arrestin2在内毒素诱导的肝脏损伤中的作用机制.方法 建立内毒素诱导的肝脏损伤模型,将β-arrestin2基因敲除型(KO)小鼠20只及同窝β-arrestin2野生型(WT)小鼠20只分别随机分成实验组及对照组(n=10),实验组腹腔内注射脂多糖(5 mg/kg),而对照组注射等量生理盐水,6h后留小鼠血清和肝脏组织标本.实时定量PCR检测小鼠体内β-arrestin2表达量,ELISA检测各组小鼠血清中ALT、AST及TNF-α水平,蛋白免疫印迹法检测各组β-arrestin2、p-p65及p-IκBα蛋白的表达.结果 β-arrestin2 WT实验组肝脏组织中β-arrestin2 mRNA为0.18 ±0.06,明显低于正常对照组的1.00±0.29(t=-4.669,P＜0.001),β-arrestin2蛋白表达也明显低于WT对照组;β-arrestin2 KO实验组血清ALT为(204.33±22.33) U/L、AST为(403.40 ±53.45) U/L,明显高于β-arrestin2 WT实验组ALT的(129.33 ±9.69) U/L和AST (256.20±40.47) U/L (t=7.55、6.94,P均＜0.001).β-arrestin2 KO实验组血清TNF-α为(155.89±14.89) pg/L,明显高于WT实验组的(101.36±10.65) pg/L(=9.25,P＜0.001).β-arrestin2 KO实验组肝脏组织中p-IκBα及p-p65的蛋白表达量明显高于β-arrestin2 WT实验组.结论 β-arrestin2可能通过抑制NF-κB活化、减少TNT-α释放从而减轻内毒素诱导的炎症反应,在内毒素诱导的肝脏损伤中起保护作用.
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RNAi沉默β-arrestin2基因对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响
目的:通过体外实验观察β-arrestin2的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人乳腺癌Bcap37细胞凋亡的影响.方法:针对β-arrestin2基因设计siRNA序列,克隆到空载体PGPU6/GFP/Neo,转化DH5α菌株,提取质粒,进行测序分析.在脂质体lipofectamineTM2000的介导下转染Bcap37细胞,同时转染空白对照组及阴性对照组.转染后用定量Western blot检测Bcap37细胞β-arrestin2蛋白的表达情况,流式细胞仪检测Bcap37细胞的凋亡情况.结果:我们的研究表明,β-arrestin2的siRNA能有效下调β-arrestin2的表达,与对照组相比,β-arrestin2干扰组 β-arrestin2的表达明显下降(P <0.05);β -arrestin2干扰组Bcap37细胞凋亡率显著高于对照组.结论:β-arrestin2干扰组能有效降低β-arrestin2的表达,有效促进Bcap37细胞凋亡;β-arrestin2可能成为乳腺癌基因治疗的一个新靶点.
关键词： β-arrestin2 小分子干扰RNA Bcap37细胞 细胞凋亡 -
β－arrestin2基因转染对人肺腺癌细胞 A549的凋亡影响
目的：观察外源性β－arrestin2基因对人肺腺癌细胞株 A549凋亡的影响。方法：将真核表达重组体pcDNA3．1－β－arrestin2质粒和空载体 pcDNA3．1质粒采用脂质体转染技术分别导入人肺腺癌 A549细胞，然后采用 G418筛选方法获得稳定转染的细胞系，采用 qRT －PCR 和 Western blot 分别在基因水平和蛋白水平检测β－arrestin2基因的表达。采用流式细胞仪分析转染细胞的凋亡情况。结果：经脂质体转染和筛选，建立了稳定表达β－arrestin2基因的 A549细胞系。转染β－arrestin2基因的细胞生长速度较未转染组和转染空白载体组相比明显减慢（P ＜0．05）。结论：β－arrestin2基因可促进人肺腺癌细胞 A549的细胞凋亡。
关键词： β-arrestin2 肺腺癌 A549 细胞 细胞凋亡
