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BMP-2诱导软骨细胞凋亡及增殖的研究
背景:骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)一直被认为具有多种不同的生物活性,包括调控细胞增殖、分化和凋亡的调节、迁移、胚胎发育和维持组织稳态.目的:研究BMP-2对软骨细胞的影响,以及其在软骨细胞内表达对TGF-β、SOX-9、ERCC-1的影响.方法:用质粒转染关节软骨细胞,构建BMP-2过表达模型.显微镜下观察转染前后软骨细胞的形态.流式细胞仪下观察转染前后软骨细胞凋亡情况.ELISA方法观察转染前后软骨细胞中II型胶原蛋白的表达情况.分别采用Western blot和荧光定量PCR检测转染前后细胞内TGF-β、Sox-9、ERCC1蛋白和基因的表达情况.结果:软骨细胞转染BMP-2后,II型胶原表达量、软骨细胞增殖和凋亡显著增加;TFG-β,SOX-9,ERCC-1蛋白表达升高;TFG-β和SOX-9基因表达量显著增加(P<0.05,P<0.01).ERCC1基因表达量亦增加,但与转染前相比无显著统计学差异(P>0.05).结论:BMP-2能增加软骨细胞II型胶原表达,诱导软骨细胞凋亡,促进软骨细胞增殖.同时,BMP-2能够促进TFG-β、SOX-9、ERCC-1蛋白及基因表达量.
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负载SOX-9的大鼠脂肪干细胞成软骨分化的实验研究
目的 SOX-9基因转染大鼠的ADSCs(Adipose stromal cells,ADSCs),诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法.方法 分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;SOX-9基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测.结果 成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染SOX-9的ADSCs在目的基因SOX9、Aggrecan、Collagen Ⅱ mRNA的表达和软骨特异性基质-Collagen Ⅱ的分泌上明显高于转染空载体组和对照组;结论 SOX-9基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞.
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慢病毒介导的 Sox-9基因转染对大鼠关节软骨细胞炎性反应的影响
目的：评价 Sox-9基因过表达对IL-β诱导的大鼠关节软骨细胞（RCs）炎性反应的影响，为临床提供参考依据。方法通过慢病毒（Lv-Sox-9）感染的方法在RCs细胞中过表达Sox-9，RT-PCR ，Western blot检测病毒感染后大鼠软骨细胞中 Sox-9、CollagenⅡ基因mRNA及蛋白含量；将细胞分为3组，细胞对照组，IL-1β诱导组，对照病毒感染且IL-1β诱导组和Sox-9过表达且IL-1β诱导组，将软骨细胞或者病毒感染后的软骨细胞接种于纳米孔氧化铝膜上，正常条件培养24 h后，诱导组细胞培养液中添加5μg／L的IL-1β，继续培养3 d ，CCK-8法检测细胞增殖活性变化、扫描电镜观察细胞形态及代谢变化。结果通过慢病毒感染的方法可以在大鼠关节软骨细胞中有效上调Sox-9基因的表达，病毒感染后72 h ，Lv-Sox-9感染组细胞内Sox-9 mRNA和蛋白含量均显著高于细胞对照组和对照病毒组；检测结果还显示，Rcs细胞内CollagenⅡ基因在转录和蛋白表达水平均与Sox-9正相关。结论 Sox-9可以作为抗炎治疗的潜在目标基因。
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SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞的可行性
背景:SOX-9在软骨组织的发生和发育中具有重要作用,可促进间充质细胞凝集,具有转录激活结构域,能直接调控转录.目的:选用SOX-9基因构建pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,观察SOX-9基因对骨髓基质细胞生长特性及产物表达的影响.设计、时间及地点:细胞基因工程体外实验,于2006-06/2007-01在中国科学院北京基因组研究所完成.材料:SPF级6周龄新西兰大白兔8只,用于分离培养骨髓摹质细胞.方法:采用脂质体介导法将构建的pDC316-SOX-9质粒转染兔骨髓基质细胞,细胞转染分为SOX-9质粒转染组、空质粒组、只加入等量脂质体的空白对照组.主要观察指标:通过细胞形态、细胞生长活性、免疫组织化学及HE染色、RT-PCR法、EUSA法检测SOX-9基因转染骨髓基质细胞是否成功.结果:pDC316-SOX-9质粒转染4 d出现小片的细胞集落,挑取克隆扩增培养后,细胞呈梭形纤维状.随转染时间的延长.空白对照组细胞逐渐死亡,SOX-9质粒转染组、空质粒组的细胞活性均显著延长,在转染2周达高峰,之后逐渐降低.转染第6天,SOX-9质粒转染组骨髓基质细胞免疫组织化学染色呈棕黄色,稳定表达SOX-9蛋白,HE染色可见多个双核细胞,细胞增殖旺盛,与成软骨细胞类似:空质粒组无SOX-9蛋白表达,组胞增殖分裂不旺盛.SOX-9质粒转染组表达SOX-9 mRNA,宅质粒组及空白对照组均无SOX-9mRNA表达.转染后24,48,72h及1,2周,SOX-9质粒转染组细胞上清液中SOX-9含量均明显高于空质粒组、空白对照组(P＜0.01).结论:利用pDC316-SOX-9质粒成功转染兔骨髓基质细胞,增强细胞生长活性,并能持续稳定的分泌SOX-9蛋白,可诱导骨筒基质细胞向软骨方向分化.
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SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞向类髓核细胞的分化
背景:移植间充质干细胞预防和治疗椎间盘退变是一种可行的方法,将SOX-9和GDF-5共同转染骨髓间充质干细胞,使其向髓核细胞转化,以期获得更大的髓核诱导和促增殖效应.目的:探讨SOX-9和GDF-5基因共同诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的效果.方法:提取、分离、纯化4周龄新西兰大白兔骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞分为5组体外诱导其向类髓核细胞分化,分别为未转染组、空载体转染组、SOX-9转染组、GDF-5转染组、共转染组.转染后第14 天采用RT-PCR检测SOX-9,GDF-5和Ⅱ型胶原的mRNA表达,免疫组化染色法检测髓核细胞标记物KRT19表达.结果与结论:共转染组SOX-9 mRNA表达高于转染SOX-9组,差异有显著性意义(P < 0.05);共转染组GDF-5 mRNA表达高于转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).共转染组Ⅱ型胶原表达高于转染SOX-9组、转染GDF-5组,差异有显著性意义(P < 0.05).SOX-9转染组及GDF-5转染组KRT19呈阳性表达,共转染组呈强阳性表达,可见被转染的骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,且双基因转染诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的能力和分泌细胞外基质的能力明显高于单基因转染.
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调控脂肪间充质干细胞成软骨分化基因Sox-9和低氧诱导因子1α的表达
背景：有学者采用基因转染的方法诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，使种子细胞能够稳定合成和分泌特定的细胞因子，从而达到长期稳定刺激种子细胞增殖、分化和软骨形成的目的。
目的：观察胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞低氧诱导因子1α和Sox-9表达的影响。
方法：①取成年新西兰大耳白兔颈后部皮下脂肪组织，分离、培养兔脂肪间充质干细胞，免疫荧光法鉴定后在脂质体介导下应用pcDNA3.1-IGF-1基因转染脂肪间充质干细胞，G418筛选，获得稳定转染的细胞株；②实验分为3组：正常传代培养的脂肪间充质干细胞；转染pcDNA3.1的脂肪间充质干细胞；转染pcDNA3.1-IGF-1的脂肪间充质干细胞。③RT-PCR及Western blot法检测转染后细胞中胰岛素样生长因子1的表达，MTT法绘制细胞增殖曲线，Dil荧光染料标记后计数细胞增殖效率，免疫荧光法分析转染后细胞低氧诱导因子1α和Sox-9的表达情况，DMMB定量测定总糖胺聚糖含量。
结果与结论：①成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株，RT-PCR及Western blot检测证实转染后的细胞株在mRNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达，并且成功翻译为蛋白；②MTT提示转染后细胞增殖活性增强；③胰岛素样生长因子1基因转染显著提高Dil标记脂肪间充质干细胞的增殖效率；④转染后细胞的低氧诱导因子1α和Sox-9表达阳性；⑤胰岛素样生长因子1基因转染组糖胺聚糖含量明显高于其他2组(P<0.01)。⑥结果说明，胰岛素样生长因子1基因转染能够能够有效促进脂肪间充质干细胞增殖，促使阳性表达低氧诱导因子1α和成软骨分化调控基因Sox-9，并有效促进细胞分泌软骨细胞外基质糖胺聚糖。 -
SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞的分化
背景:单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果.目的:验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果.设计、时间及地点:两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成.对象:6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取.方法:扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9.分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞.按转染情况分为5组:①未转染组:仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM.②转染窄载体组:双无L-DMEM+pcDNA3.1空载体和脂质体.③转染SOX-9组:双无L-DMEM+pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体.④转染胰岛素样生长因子1组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体.⑤共转染组:双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合.主要观察指标:对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达.结果:MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P<0.01).反转录-聚合酶链反应和Westem blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组多:软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组多.结论:双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9.
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Sox-9和igf-1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究
目的 探讨应用Sox-9和igf-1基因转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)后,目的 基因和蛋白分泌情况及向软骨细胞的分化效果.方法 扩增、提取质粒pcDNA3.1-igf-1、pcDNA3.1-Sox-9,分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,将Sox-9和igf-1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染Sox-9组(C组)、转染igf-1组(D组)、Sox-9与igf-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达.结果 MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01).但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR和Western blot检测目的 基因和蛋白的表达量,Sox-9表达以C组多;igf-1表达以E组多;Ⅱ型胶原表达以E组多.结论 通过Sox-9和igf-1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向.
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重组腺病毒介导SOX-9基因对颈椎关节突软骨细胞凋亡的影响
目的 探讨重组腺病毒介导的人SOX-9(AdSOX-9)对人的颈椎关节突关节软骨细胞凋亡细胞数目及Caspase-3基因表达的作用及相关意义,更好理解颈椎软骨退变的发生机制.方法 应用AdSOX-9按照不同浓度及作用时间处理体外培养软骨细胞,应用TdT介导dUTP-生物缺口末端标记方法(TUNEL)及免疫染色方法观察凋亡细胞数量及Caspase-3基因表达变化情况.结果 25MOI、50MOI剂量作用组TUNEL阳性细胞较空白对照组均明显增加;AdSOX-9转染软骨细胞预处理后,空白对照组、25MOI作用组、50MOI三种处理组Caspase-3表达均明显增加,各时点较空白对照组比较,存在显著性差异(P＜0.05).结论 SOX-9基因对软骨凋亡细胞数目、Caspase-3凋亡基因的影响,存在时间-剂量依赖关系,为软骨细胞退变发病机制研究提出新的思考.
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BMP-2对人退变椎间盘髓核细胞影响的实验研究
[目的]探讨BMP -2对人退变髓核细胞合成细胞外基质的影响.[方法]分离、培养人退变椎间盘髓核细胞,取第2代髓核细胞,随机将退变推间盘髓核细胞分为2组.A组:加入100 ng/ml BMP -2,B组:加入200 ng/mlBMP -2,C组:对照组,不加干扰因素.通过对试验组和对照组髓核细胞采用光镜、电镜等形态学方法进行大体形态和超微结构观察,细胞Ⅱ型胶原和糖胺多糖的mRNA表达.ELISA检测细胞培养上清中人Ⅱ型胶原含量,DMMB比色法检测细胞培养上清中糖胺多糖含量.[结果]髓核细胞中Ⅱ型胶原、糖胺多糖表达水平实验组均高于对照组.[结论] BMP-2蛋白可促进退变腰椎间盘细胞分泌蛋白多糖和Ⅱ型胶原,增加细胞活性,恢复椎间盘的功能和活性,因此运用BMP-2椎间盘内注射有望成为椎间盘退变疾病生物治疗的方法之一.
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软骨形成因子及骨生成因子在骨重塑中的作用
软骨损伤会引起软骨下骨改变，然损伤后修复，对骨科医师来讲，一直是个难题。因软骨无血管，只有软骨细胞，损伤后其自身修复能力非常有限。目前，许多方法的治疗效果均不理想。目前，学术界普遍认为软骨全层损伤会引起骨关节炎，终执行关节置换［1］。近年来，许多学者发现，在性别的分化、胚胎的发育、骨骼及神经系统发育的过程中，SOX基因家族起着至关重要的作用。有研究揭示在胚胎的软骨生发区，sry相关高迁移率蛋白转录因子（Sry‐related high‐mobility‐group box transcription factor ，Sox‐9）的表达很高，并影响Ⅱ型胶原（COLⅡ）的合成，对软骨生成产生作用［2］。与此同时，runt相关转录因子2（runt‐related transcription factor 2，RunX‐2）在成骨及软骨细胞的分化、成熟、基质蛋白生成方面都有着重要的作用。该综述针对软骨诱导生成蛋白 Sox‐9和骨诱导生成蛋白RunX‐2对软骨损伤后，软骨下骨的重塑作用作一总结。
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大鼠肌腱干细胞的分离培养鉴定及拉力对其Sox-9表达的影响
目的 分离培养大鼠肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs)并检测其干细胞特性,观察拉力对大鼠TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响.方法 取SPF级12周龄SD大鼠两侧髌腱,胶原酶消化,以低密度接种分离出TSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,结晶紫染色观察克隆形态和数量,流式细胞术检测其MSCs表面标记进行鉴定.体外力学加载仪对第3代TSCs施加4％、0.17 Hz的拉力作为实验组,对照组TSCs未进行拉力加载,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测拉力对TSCs Sox-9基因和蛋白表达的影响.结果 倒置相差显微镜观察示,分离出的原代细胞主要呈星状,第1代细胞呈纤维细胞状.分离出的细胞7d后形成单细胞克隆;流式细胞仪检测示其CD29、CD44、CD90表达阳性,CD45表达阴性.荧光定量PCR和Western blot法检测示,与对照组相比,实验组拉力加载后4 h Sox-9基因水平下调、蛋白表达明显降低,24 h Sox-9基因水平上调、蛋白表达明显增多,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 成功分离大鼠TSCs且符合MSCs特性;拉力刺激初始抑制了Sox-9表达,但拉力刺激完全消失后Sox-9表达上升.
