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arresten对人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的抑制作用的研究
目的探讨arresten抑制人胃癌细胞SGC-7901裸鼠移植瘤生长的作用.方法构建包含arresten cDNA的分泌型真核表达质粒pcDNA3.1(+)-ss-arresten,并以脂质体法将重组质粒转染至SGC-7901细胞.蛋白印迹法(Western blot)检测SGC-7901是否分泌表达arresten,同时,通过生长曲线绘制及生长周期测定的方法了解上述转基因措施本身对SGC-7901细胞的体外生物学特性的影响.将转基因的SGC-7901细胞株接种至裸鼠皮下,使其在接种局部表达arresten,观察肿瘤生长情况.结果成功构建了分泌型真核表达载体pcDNA3.1(+)-ss-arresten,并获得了可分泌表达arresten的人胃癌SGC-7901细胞株.质粒转染对SGC-7901细胞增殖特性无影响.转基因SGC-7901细胞的裸鼠移植瘤生长缓慢.结论 arresten抑制人胃癌SGC-7901移植瘤的生长,其途径可能是通过抑制其滋养血管的生长而实现.
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arresten cDNA在人胃癌细胞SGC-7901中的表达及活性鉴定
目的:构建arresten cDNA的分泌型真核表达载体,将其转染人胃癌SGC-7901细胞,探讨arresten体外抑制血管内皮细胞生长的活性.方法:利用PCR法将小鼠Ig κ链信号序列的60个碱基拼接至arresten cDNA的氨基端,并克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),然后以脂质体法将重组pcDNA3.1(+)-arresten转染SGC-7901细胞,Western印迹检测arresten的分泌表达,后,提取SGC-7901细胞培养上清,采用内皮细胞增殖抑制试验鉴定上清中arresten活性.结果:成功构建了arresten cDNA的分泌型真核表达载体,获得可表达arresten的SGC-7901细胞系,真核表达的arresten具有抑制血管内皮细胞增殖的活性.结论:arresten是一种有效的血管生成抑制剂,其cDNA的真核表达载体的成功构建为针对人类胃癌的arresten抗血管基因治疗研究奠定基础.
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Arresten蛋白通过调控上皮-间质转化抑制宫颈癌细胞的迁移
目的 探讨Arresten蛋白对宫颈癌Siha细胞迁移的影响及其可能的作用机制.方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验、划痕实验和Boyden小室趋化实验检测Arresten蛋白对宫颈癌Siha细胞增殖及迁移能力的影响;通过免疫细胞化学法检测细胞迁移分子标志基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平;利用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质印迹法检测上皮-间质转化(EMT)标志物E-cadherin与N-cadherin的水平变化.结果 经3.2μg/ml Arresten蛋白处理的Siha细胞,其增殖能力没有明显改变(P>0.05).通过对划痕实验中细胞迁移距离和穿越Boyden小室的细胞数目进行分析,发现经3.2μg/ml Arresten蛋白处理的Siha细胞迁移功能受到抑制(P<0.01),细胞内迁移分子标志基质金属蛋白酶(MMP)-9的表达水平也显著降低(P<0.01).Arresten蛋白可诱导Siha细胞内上皮标志物E-cadherin表达上调(P<0.01),间充质细胞标志物N-cadherin表达下调(P<0.01).结论 Arresten蛋白对宫颈癌细胞迁移有抑制作用,可能通过抑制EMT途径发挥作用..
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Arresten对人脐静脉内皮细胞增殖的影响及其作用机制
背景与目的:Arresten是近年发现的血管生成抑制因子,它能抑制裸鼠移植瘤的生长和转移.本文探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖的影响及其相关机制.方法:应用MTT法测试细胞的生长曲线,检测不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响,流式细胞仪检测arresten对huvec细胞凋亡的影响,半定量RT-PCR及Western-blot分别检测人脐静脉内皮细胞的VEGF在 mRNA水平及蛋白水平的表达.结果:MTT比色法显示,arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用并呈浓度依赖性,但当其浓度增加到800ng/L后其增殖抑制率不再提高,而此浓度时huvec细胞的凋亡率达到峰值的59%;经过arresten处理,huvec细胞的VEGF在mRNA及蛋白水平的表达量均显著下降.结论:arresten通过降低huvec细胞的VEGF表达抑制huvec细胞增殖并促进huvec细胞凋亡.
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Arresten抑制HUVEC细胞增殖和管腔形成的实验研究
目的:探讨血管生成抑制因子arresten对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖和体外血管腔形成的影响,了解其抑制血管生成的途径.方法:采用MTT比色法,观察不同浓度的arresten对HUVEC细胞增殖的影响;Matrigel胶体外管腔形成试验检测arresten对HUVEC细胞形成血管的影响.结果:MTT比色法显示,arresten对HUVEC细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,arresten对HUVEC细胞增殖抑制作用也增强,但当其浓度增加到800 ng/mL后其增殖抑制率不再提高;arresten浓度为0、400及800 ng/mL时,HUVEC细胞形成的血管腔数分别为17±2、9±1及5±1.结论:Arresten能够抑制HUVEC细胞的增殖,并抑制HUVEC细胞形成血管腔.
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血管生成抑制因子arresten抑制huvec细胞增殖和迁移的实验研究
目的 探讨arresten对人脐静脉内皮细胞huvec增殖和迁移的影响,了解其抑制血管生成的途径.方法 采用MTT比色法,观察不同浓度的arresten对huvec细胞增殖的影响,Transwell小室检测arresten对huvec细胞迁移的影响.结果 MTT比色法显示,arresten对huvec细胞增殖具有抑制作用,随着浓度的增加,arresten对huvec细胞增殖抑制作用也增强,但当其浓度增加到800 μg·L-1后其增殖抑制率不再提高;arresten浓度为0、400 μg·L-1及800 μg·L-1时迁移至Transwell小室膜下的huvec细胞数分别为105±8、77±9、53±6(0.05＞P＞0.01).结论 arresten能够抑制huvec细胞的增殖和迁移,这可能是其抑制血管生成的途径之一.
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内源性血管生成抑制因子Arresten在E.coli JM109中的表达及抗新生血管生成的药理学研究
目的 构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并进行表达,抑制新生血管的药理学实验中发现,该表达产物具有抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能.方法 从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coli JM109进行原核表达,大量表达提取Arresten蛋白,用鸡胚绒毛尿囊膜实验进行活性测定.结果 成功构建的重组质粒pBV220-Arr在E.coli JM109菌株中2～8 h均可获得表达,其中诱导4 h表达效率高,Arresten蛋白可明显抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生长,活性功能明显强于血管抑素.结论 成功构建Arresten基因重组质粒pBV220-Arr,并可在E.coli JM109菌株中获得表达,Arresten蛋白具有明显的抑制血管生成的作用.
关键词： Arresten 原核表达载体 E.coli JM109 基因表达 活性 -
Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制
目的 探讨Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制.方法 选取48只出生后7d健康清洁级C57BL/6J幼鼠,随机分为氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)组、OIR+Arresten组和常氧组,每组16只.OIR+ Arresten 组及OIR组幼鼠在体积分数为(75±2)％的高氧环境下饲养5d,然后转移至正常氧气环境中饲养5d,其中OIR+ Arresten组幼鼠于高氧饲养刚结束时,给予双眼玻璃体内注射Arresten蛋白.常氧组幼鼠则在常规氧气环境中连续饲养10 d.在鼠龄17 d时,各组取6只幼鼠经股静脉注射异硫氰酸葡聚糖溶液处死并摘出眼球,视网膜铺片后观察视网膜的血管形态、计算无灌注区面积.同时对小鼠眼球视网膜行石蜡切片和HE染色,计算侵入玻璃体内血管内皮细胞核的数量.同时,通过细胞培养实验,利用MTT法检测Arresten蛋白对人血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果 视网膜铺片结果显示,常氧组、OIR组、OIR+ Arresten组视网膜无灌注区相对面积分别为(2.35±1.62)％、(57.28±9.36)％和(20.38±8.69)％,三组间总体比较,差异有统计学意义(F=18.732,P＜0.05),且OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+ Arresten组,差异有统计学意义(P＜0.05).常氧组小鼠视网膜的内界膜结构仍保持平滑完整,未发现有新生血管侵入玻璃体内.OIR组和OIR+ Arresten组每张切片上血管内皮细胞核的数量分别为(15.18±4.83)个、(7.33±3.88)个,其中OIR+ Arresten组侵入玻璃体内新生血管内皮细胞核的数量显著低于OIR组,差异有统计学意义(P＜0.05).Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制率随着其浓度的升高而增加,但当Arresten蛋白浓度达到1000 μg·L-1时,人脐静脉内皮细胞的增殖抑制率达到顶峰,为(58.00±0.65)％.结论 Arresten蛋白能够抑制氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成,通过抑制血管内皮细胞增殖来抑制新生血管形成.
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结肠癌组织中arresten基因的表达
目的:探讨arresten基因在结肠癌组织中的表达及意义.方法:采用RT-PCR检测42例结肠癌癌组织及相应的癌旁组织和远癌组织中arresten mRNA的表达情况.PCR产物经凝胶电泳,比较各组织中arresten与β-actin条带的灰度值之比,半定量分析arresten mRNA的表达水平.结果:癌组织中arresten mRNA表达水平(0.43±0.14)低于癌旁组织(0.51±0.13)和远癌组织(0.57±0.11);随着肿瘤分化程度的升高,arresten mRNA在癌组织巾的表达也增加(P＜0.05),但arresten mRNA表达在结肠癌临床分期(TNM)、淋巴结转移和病理类型间差异无统汁学意义(P＞0.05).结论:arresten mRNA在结肠癌组织巾低表达,arresten基因在结肠癌的发生发展过程可能发挥重要作用.
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重组arresten蛋白对自体移植静脉内膜增生的抑制作用
目的 观察原核表达人arresten重组蛋白对自体移植静脉内膜增生的抑制作用.方法 用pRSET原核表达系统表达并纯化人arresten重组蛋白.将Wistar大鼠颈外静脉移植于腹主动脉,建立大鼠自体静脉移植模型,实验分3组:假手术组、移植对照组和移植实验组.自术后第3天起,皮下注射给予arresten重组蛋白(每日4 mg/kg体重)处理.4周后取移植静脉组织标本,进行病理组织学观察与免疫组织化学染色分析.结果 移植组移植静脉均呈现典型的内膜增生、肥厚,导致血管管腔狭窄;新生内膜主要有过度增殖的α-SMA染色阳性平滑肌细胞组成.移植实验组移植静脉内膜增生受到明显抑制,新生内膜面积(0.12±0.07)mm2及新生内膜/中膜面积比(0.373±0.085)均显著低于对照组[(0.38±0.11)mm2,1.621±0.086,P<0.01];并且实验组移植静脉新生内膜细胞PCNA标记指数显著低于对照组[(15.62±3.97)%比(56.36±3.49)%,P<0.01].结论 重组arresten蛋白通过抑制新生内膜平滑肌细胞的增殖能有效抑制自体移植静脉内膜增生的发生发展,在防治血管重建术后再狭窄方面显示出良好的应用前景.
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血管生成抑制因子arresten的真核表达体系的建立
目的 构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系.方法用脂质体转染法,通过真核表达载体pSecTag2-arresten将arresten基因导入CHO细胞,经抗生素Zeocin筛选获得阳性细胞克隆,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测arresten mRNA表达,免疫蛋白印迹技术(Westem-blot)测arresten蛋白的表达.结果经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞,RT-PCR、Western-blot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达.结论获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆,为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础.
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人arresten基因转染对自体移植静脉内膜增生的影响
目的 探讨体内转染arresten基因对自体移植静脉内膜增生的影响.方法 建立大鼠自体静脉移植模型.血管吻合术前,用脂质体介导重组质粒pSecTag2-AT(Ⅰ组),空载体pSecTag2转染(Ⅱ组)移植血管,等体积脂质体溶液处理移植血管(空白对照组,Ⅲ组).各组动物均于4周后切取移植血管,RT-PCR检测移植血管中arresten mRNA的表达;常规HE,Verhoeff弹力纤维染色;计算机图象分析检测移植静脉血管内膜及中膜面积、厚度;免疫组化检测移植血管内膜α-SMA及PCNA的表达;Western blot检测TGF-β1蛋白的表达.结果 Ⅰ组转染的移植静脉中有目的基因mRNA的表达, 而Ⅱ、Ⅲ组无Ⅰ组内膜、中膜面积小均于Ⅱ组和Ⅲ组,差异有显著性(P＜0.05).而内膜面积/中膜面积3组间无统计学差异(P＞0.05);Ⅰ组内膜厚度小于Ⅱ组和Ⅲ组,组间比较有统计学差异(P＜0.01);α-SMA染色表明增生内膜中的细胞是血管平滑肌细胞;PCNA阳性细胞数及表达指数Ⅰ组均低于Ⅱ组和Ⅲ组(P＜0.05);Ⅰ组TGF-β1蛋白的表达明显低于Ⅱ组和Ⅲ组.结论 移植血管转染arresten基因,可有效抑制自体移植静脉内膜的增生,在防治血管移植术后再狭窄方面显示出良好的临床应用前景.
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Arresten对血管平滑肌细胞作用和机制的研究
目的 探讨arresten蛋白对人血管平滑肌细胞的作用以及可能的相关调控机制.方法 采用实时活细胞动态成像实验检测不同浓度arresten对血管平滑肌细胞增殖能力的影响;采用蛋白芯片检测在arresten作用下血管平滑肌细胞内差异性表达的相关细胞因子;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测相关细胞因子的差异性表达.结果 实时活细胞动态成像显示arresten能够抑制血管平滑肌细胞增殖水平;蛋白芯片实验显示arresten作用下血管平滑肌细胞内Angiogenin、Endoglin及TIMP-1具有差异性表达;RT-PCR结果验证了在arresten作用下血管平滑肌细胞内Angiogenin的差异性表达,Endoglin和TIMP-1表达差异不明显.结论 arresten对血管平滑肌细胞增殖有抑制作用,其机制可能通过Angiogenin参与信号通路的调节来发挥作用.
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arresten基因转染对裸鼠实验性结肠癌肝转移的抑制作用
背景与目的:肝转移是晚期结肠癌患者常见的致死原因,也是常见的内脏转移,高达50%以上的结肠癌患者都会出现肝转移.本研究探讨arresten基因转染对人结肠癌LoVo细胞形成的裸鼠实验性结肠癌肝转移的影响.方法:通过脂质体转染法将arresten基因导入LoVo细胞,RT-PCR、Western blot分别检测arresten在mRNA、蛋白水平的表达,四甲基噻唑蓝(MTT)比色法检测arresten对LoVo细胞增殖的影响;通过建立裸鼠实验性结肠癌肝转移模型了解arresten对肿瘤转移的抑制作用;FⅧRag多克隆抗体染色的免疫组化方法检测肿瘤组织的微血管密度(microvessel density,MVD).结果:RT-PCR、Western blot结果显示arresten基因成功导入LoVo细胞并有arresten蛋白的表达.MTT比色法显示不同浓度的arresten对LoVo细胞增殖的影响差异无统计学意义(P＞0.05).导入arresten基因的LoVo细胞转移率为(25.1±2.1)%,低于未导入arresten基因的LoVo细胞的(87.1±1.2)%和对照组的(87.1±1.5)%,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSecTag2-arresten组裸鼠形成的肿瘤结节数为4.5+0.5,低于另外两组的19.6±2.5和20.4±2.5,其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).pSeeTag2-arresten组形成的肿瘤MVD为15.3±3.5,低于另外两组(分别为42.2±2.6、45.6+5.1),其差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论:arresten能抑制结肠癌肝转移,其作用机制可能与arresten抑制肿瘤血管生成有关.
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血管生成抑制因子Arresten研究进展
肿瘤的生长、转移依赖于血管增生,抑制新血管的生成可使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导其死亡.本文主要对血管生成抑制因子Arresten的结构、功能以及应用研究作了综述,并对其在肿瘤治疗和新药开发中的意义进行了展望.
